DNA微阵列技术检测不同HCY水平患者MTHFR基因多态性
2016-12-19胡国艳王华成林裕龙
张 婷， 胡国艳， 王华成， 许 莹， 林裕龙
DNA微阵列技术检测不同HCY水平患者MTHFR基因多态性
张 婷， 胡国艳， 王华成， 许 莹， 林裕龙
目的 检测不同水平同型半胱氨酸(HCY)患者5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因第677核苷酸的突变频率，探讨MTHFR基因多态性与不同HCY水平的相关性。方法 以HCY大于15 μmol/L的受检者(435例)作为实验组，将实验组按照HCY水平分成4组：15 μmol/L 同型半胱氨酸； 亚甲基四氢叶酸还原酶； 基因型； 等位基因频率 HCY是所有S-腺苷甲硫氨酸依赖的转甲基化反应的产物，参与DNA沉默后调节和组蛋白翻译后修饰的过程。血液循环中HCY升高可引发一系列疾病，包括心脑血管疾病、自身免疫性疾病、肠胃疾病、骨骼疾病和神经退行性疾病等[1]。一项Meta分析指出，空腹血中HCY每升高3 μmol/L，局部缺血性心脏病风险增加11%，脑卒中风险增加19%[2]，同时高HCY血症也被认为是阿尔茨海默症的独立危险因素。因此，HCY的代谢及调节机制是目前研究的热点之一。MTHFR是体内降解HCY的重要生物酶，MTHFR基因被认为是影响血液HCY水平最重要的遗传因子，该基因第677位核苷酸突变非常常见，在人群中可存在3种基因型：677CC、677CT和677TT。其中677CC为野生型，677CT和677TT分别为杂合突变型和纯合突变型，基因突变后所编码的酶受热易分解且酶活性降低，从而引起HCY升高。目前众多医疗机构将15 μmol/L作为人群中HCY参考范围的上限，因此本研究将HCY高于15 μmol/L的患者作为实验组进行分组，通过分析不同HCY水平的患者MTHFR基因型及等位基因的频率分布，探讨MTHFR第677位基因变异与不同HCY水平的相关性。 1.1 研究对象 实验组为广州市惠爱医院2015年2月-2015年9月住院的HCY异常患者，共435例，男363例、女72例，平均年龄(48.92±16.52)岁，HCY平均水平为(24.50±8.74)μmol/L，实验组按HCY水平分为4组：15 μmol/L 1.2 仪器和试剂 1.2.1 HCY检测 AU5811全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)，HCY试剂为北京九强公司产品。 1.2.2 MTHFR 基因多态性检测试剂 ABI 7300实时荧光PCR扩增仪(美国ABI公司)，芯片杂交仪、芯片识读仪以及DNA微阵列检测MTHFR C677T基因多态性试剂盒均购自上海百傲公司。 1.3 DNA微阵列技术检测MTHFR基因多态性 1.3.1 提取DNA模板 取EDTA抗凝全血200 μl，按DNA提取试剂盒说明书操作提取人基因组DNA。DNA样本置-20 ℃保存，避免反复冻融。 1.3.2 PCR扩增及杂交反应 按照MTHFR基因多态性试剂盒说明书操作。 1.3.3 结果判读 基因芯片杂交后经BE2.0芯片识读仪扫描，根据差异的基因位点和图谱，用Array Doctor微列阵分析软件判定所检测基因的基因型。 1.4 DNA测序验证 随机抽取各种基因型各2例，送深圳华大基因进行测序，以验证DNA微阵列技术检测MTHFR基因型的准确性。 1.5 统计学分析 统计方法采用“行×列的χ2检验”和“χ2检验”，由SPSS 19.0统计软件分析完成。 2.1 DNA微阵列技术检测MTHFR 677基因型与测序结果比较 随机抽取的3种基因型各2例与测序结果比较，两者完全一致。DNA微阵列技术检测MTHFR 677多态性的杂交图谱(见图1)，DNA测序图谱(见图2)。 2.2 DNA微阵列技术检测MTHFR 677基因多态性结果 MTHFR 677基因多态性结果(见表1)，经“行×列的χ2检验”，T等位基因频率与HCY水平显著相关(χ2=180.16，P<0.0001)，且随着HCY水平升高，T等位基因频率呈增大趋势，经线性趋势检验有统计意义(χ2=156.67，P<0.0001)。而对照组和一组(HCY轻度升高)比较，MTHFR C677T基因型分布及等位基因频率无显著差异(χ2=0.031，P>0.05)(见表1)。 表1 不同HCY水平的MTHFR基因型分布与等位基因频率 备注：P1为对照组T等位基因频率与实验组比较，具有显著差异；P2为对照组T等位基因频率与第1组比较，没有显著差异 MTHFR 677CC MTHFR 677CT MTHFR 677TT MTHFR 677CC MTHFR 677CT MTHFR 677TT MTHFR通过不可逆地催化5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，后者作为甲基供体与体内的HCY结合，在蛋氨酸合成酶的催化下，使HCY转化为蛋氨酸[3～6]。因此MTHFR的活性高低可直接影响整个反应链的效率。人类编码MTHFR的基因的cDNA序列中第677位核苷酸由C到T的突变，产生一个Hinf I限制性酶切位点，造成所编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，这一突变可造成MTHFR的酶活性下降[5]。 为了研究HCY水平与MTHFR基因频率分布的相关性，我们选择了性别、年龄组成和生活环境等无显著差异的4组实验组和对照组。检测不同组别人群的MTHFR基因型和等位基因频率，结果显示对照组、1组、2组、3组、4组的TT基因型分布为1.7%、2.4%、8.2%、21.2%和50.8%；T等位基因频率分别为0.207、0.212、0.306、0.403和0.670。经统计分析，MTHFR 677 T等位基因频率与HCY水平显著相关(χ2=180.16，P<0.0001)，且表现为随HCY水平升高T等位基因频率显著增大，线性趋势检验有统计意义(χ2=156.67，P<0.0001)。HCY水平与MTHFR 677 T等位基因频率呈正相关，提示MTHFR C677 T 基因T等位基因突变是引起HCY水平升高的重要原因。并且在HCY>30 μmol/L的人群，MTHFR 677 T等位基因频率达0.670，提示MTHFR677 T等位基因是导致受检者超高HCY水平的主要原因。 本研究中，将一组与对照组的MTHFR等位基因频率单独进行卡方分析，结果显示MTHFR基因型分布和等位基因频率没有显著差异(χ2=0.031，P>0.05)，这提示HCY轻度升高(HCY≤20 μmol/L)并非由MTHFR 677位基因由C突变为T导致MTHFR 酶活性改变引起，而是由其它原因所致，如代谢过程中原料不足或是其它器质性疾病等因素[7]。即使在HCY处于中等升高的受检者中(2、3组)，T等位基因的频率分别仅为0.306和0.403，说明MTHFR 677位基因由C突变为T并非导致这类受检者HCY升高的主要原因，或许还存在其它较为温和的基因突变。通过检测MTHFR基因型以查明HCY水平升高是基因突变还是其它原因所致将有助于临床制定相应的应对措施。 综上所述，MTHFR基因677位核苷酸由C突变为T对HCY水平影响显著，以HCY水平大于20 μmol/L为界的升高与MTHFR基因的突变率呈正相关，对临床有较明确的指导价值。DNA微阵列技术可以对MTHFR基因突变进行准确快速的检测，方便临床对HCY升高患者进行有针对性的个体化诊断和治疗。 [1]Schalinske KL,Smazal AL.Homocysteine imbalance:a pathological metabolic marker[J].Adv Nutr,2012,3(6):755-762. [2]Smulders YM,Blom HJ.The homocysteine controversy[J].J Inherit Metab Dis,2011,34(1):93-99. [3]Baggott JE,Tamura T.Homocysteine,iron and cardiovascular disease: a hypothesis[J].Nutrients,2015,7(2):1108-1118. [4]Moustafa AA,Hewedi DH,Eissa AM,et al.Homocysteine levels in schizophrenia and affective disorders-focus on cognition[J].Front Behav Neurosci,2014,8:343. [5]Keshteli AH,Baracos VE,Madsen KL.Hyperhomocysteinemia as a potential contributor of colorectal cancer development in inflammatory bowel diseases:a review[J].World J Gastroenterol,2015,21(4):1081-1090. [6]Chakrabarti S,Khemka VK,Banerjee A,et al.Metabolic risk factors of sporadic Alzheimer’s disease:implications in the pathology,pathogenesis and treatment[J].Aging Dis,2015,6(4):282-299. [7]Cascalheira JF,Joao SS,Pinhancos SS,et al.Serum homocysteine:interplay with other circulating and genetic factors in association to Alzheimer’s type dementia[J].Clin Biochem,2009,42(9):783-790. Detecting the MTHFR gene polymorphism by DNA microarray technology in patients with different HCY levels ZHANG Ting,HU Guoyan,WANG Huacheng,et al. [Department of Laboratory Diagnosis,The Affiliated Brain Hospital of Guangzhou Medical University (Guangzhou Hui-Ai Hospital),Guangzhou 510370,China] Objective To detect the 677th nucleotide mutation frequency of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) gene in patients with different levels of homocysteine (HCY) and investigate correlation of MTHFR gene polymorphism and different HCY levels.Methods 435 patients whose HCY levels were higher than 15 μmol/L were selected to be experimental group and were divided into four subgroups:15 μmol/L Homocysteine; Methylenetetrahydrofolate reductase; Genotype; Allele frequency 1003-2754(2016)06-489-03 2016-02-12； 2016-03-29 广东省科技计划项目 (No.2014A020212375) [广州医科大学附属脑科医院(广州市惠爱医院)检验科，广东 广州 510370] 林裕龙，E-mail：lyl5775541@126.com R741 A1 材料与方法
2 结 果
3 讨 论
