蚕蛹虫草及大米虫草培育技术研究

卢建珍　王建伟　刘有志　李淑芳

(山西省蚕业科学研究院,山西运城 044000)



蚕蛹虫草及大米虫草培育技术研究

卢建珍王建伟刘有志李淑芳

(山西省蚕业科学研究院,山西运城 044000)

通过选取、引进优质母种、经过转管培养获得优质原种，再繁育成液体菌种，接种在蚕蛹及大米添加蛹粉的培养基上，研究与总结菌丝培养期、转色催蕾期、子实体管理期三个主要阶段的培养条件及关键技术。

蛹虫草大米虫草液体菌种大米培养基栽培技术

蛹虫草又名北冬虫夏草、北蛹虫草、虫草等，为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科，虫草属真菌，是虫草属的模式种。其有效成分及功效与天然冬虫夏草极为相近，二者可相互代替入药，具有益肾壮阳，补肺平喘，止血化痰的功效。近几年来，由于生态环境的恶化，及人工过度采挖，天然冬虫夏草资源逐渐减少，且价格高昂，而以大米、蚕蛹等为培养基或寄主，采用液体菌种栽培蚕蛹虫草，其生长周期短，作为冬虫夏草的替代品，越来越受到人们的青睐。

蛹虫草中含有丰富的营养成份，如虫草素、虫草酸、多糖、超氧化物岐化酶、多种人体必须氨基酸、微量元素及维生素等。 经检测蛹虫草中虫草素的含量高于天然冬虫夏草；活体蛹虫草中腺苷的含量最高，大米虫草中腺苷含量稍低；虫草多糖、超氧化物岐化酶也明显高于冬虫夏草；只有虫草酸的含量略低于冬虫夏草；蛹虫草对人体具有普遍的医疗保健作用，其中所含的微量元素是治疗某些疾病时的主要成份。实验检测中发现蛹虫草中镁、磷、钙、钾、钠含量较丰富，其中活体蚕蛹栽培的虫草中磷、钾的含量最高，大米培养基虫草中钙的含量最高，菌丝体中钠的含量最高[1]。

近几年来，山西省蚕业科学研究院科研人员进行了蛹虫草培育技术的研究，主要模式有蚕蛹活体培育、大米培育、大米添加蛹粉培育虫草3种，均取得了成功。现将我院这几年的种植模式、方法、经验总结如下。

1　材料和方法

1.1菌种来源

优良菌种一般是从国内科具有资质的科研院所或生产单位直接引进纯正母种，或从野外通过采挖、选择、分离、转管培养获得。我们单位是从大连生物所引进的母种，通过转管繁育获得优良的固体原种，最终获得优良的液体菌种。

1.2固体菌种的制备

1.2.1培养基制备

土豆200 g,葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，磷酸二氢钾1.5 g，硫酸镁0.5 g,盐酸硫铵素20 mg，琼脂20 g,水1000 mL[2]，先将马铃薯冼净刮去外皮切成小块，用水煮沸25 min，用纱布过滤后取其澄清液，然后将琼脂放入用文火煮化，依次放入磷酸二氢钾、硫酸镁、葡萄糖和蛋白胨，溶化后趁热装入试管，我们采用的是18mm×180mm规格的试管，每支装液体10 mL，然后用棉塞塞紧管口后用高压锅进行灭菌消毒。保持温度121℃，压力0.1-0.11 MPa，维持30 min，晾凉出锅后趁热放成斜面待用。

1.2.2斜面菌种培养

将母种在超净工作台无菌条件下接入斜面培养基在恒温培养箱中黑暗培养，4天后菌丝萌动，此后每天见光10 h培养20 d左右，待菌丝布满整个培养基表面后保存备用。

1.3液体菌种的制备

1.3.1蛹体注射用液体菌种

在超净工作台内无菌条件下，用无菌铲刮下事先培养好的试管菌种斜面上的菌苔，然后加入10 mL左右的无菌水，研磨均匀后获得菌种悬浮液，可直接注入蛹体。

1.3.2大米培养基上采用的液体菌种：将水1000 mL，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾3 g ,硫酸镁1.5 g，维生素B210 mg，蛋白胨3 g,牛肉膏5 g，以上药品搅拌均匀装入锥形瓶中，用高压灭菌进行消毒，温度要求达到120℃，压力达到0.1～0.11 MPa后，维持30 min，出锅自然冷却后备用。在接种前首先要将接种室、接种器具和手进行消毒，然后在超净工作台内无菌条件下，将菌种从试管刮出同时放入锥形瓶中。接好的液体菌种在25℃恒温、避光环境下培养3 d，然后在转速为130～140 r/min的摇床上培养5 d，等到液体培养基中充满淡黄色菌球且液体清澈透明，说明此时的液体菌种成熟且没有遭受污染。然后用无菌水稀释5倍备用。

1.4大米培养基的制备

1.4.1普通大米培养基

将200 g土豆刮去表皮切成1 cm见方的小块，加入适量的水，煮沸，并用小火熬制25 min，过滤残渣后取上面澄清的汁液备用，待放凉后依次放入葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，柠檬酸铵1 g，维生素B11片及水1000 mL，同时搅拌均匀，测量其溶液pH值达 7～8后放置备用。

将30 g大米，40 mL营养液分装入500 mL培养瓶中，大米与混合营养液培养基的比例约为1∶1.2～1.3，如果所用培养基水分的过大，则虫草菌丝仅在培养基表面生长，后期极易造成杂菌污染；反之，如果培养基水分太少，则虫草菌丝纤弱细小，后期难以转色出草。经过测试，这种比例的大米培养基，灭菌后培养基松软不烂，米粒之间稍微有点空隙，然后用耐高温橡皮圈、旧报纸封实封口，置于高压灭菌锅中保持温度121℃，灭菌时间达到30 min或者温度达到100℃灭菌时间超过8 h均可，自然冷却到30℃以下备用。

1.4.2加蚕蛹粉的大米培养基

水1000 mL，葡萄糖10 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，维生素B13～4片，鸡蛋2个，准确称量以上物质并搅拌均匀，测得pH 7～8后放置备用，将30 g大米，蚕蛹细粉3 g， 40 mL营养液分装入500 mL培养瓶中，再用耐高温橡皮圈、旧报纸封实瓶口，置于高压灭菌锅中保持121℃灭菌30 min，冷却到30℃以下备用。

1.5蚕蛹准备

春蚕或秋蚕期，在25℃保护下的家蚕蛹，在化蛹后第二天开始削茧，同时挑选新鲜健康的鲜活家蚕蛹准备接种，需要接种的蚕蛹尽量不要超过化蛹7 d。在接种前先用75%的酒精喷洒蛹体表面进行消毒，再用无菌水洗去残留的酒精，就可以进行接种了。

2　接种方法

2.1蚕蛹接种

目前，对蚕蛹接种方法主要有3种，注射法、浸渍法和穿刺法。我们采用的是液体菌种蛹体注射法。在超净工作台内，用酒精擦拭工作台面先进行消毒，在酒精灯旁用5～10 μL微量移液器吸取6 μL的液体菌种，在蛹的腹面倒数第二腹节间膜处平行扎入蛹体，接种量根据菌浓度大小确定，一般为5～6 μL，针头拔出时在蛹体内旋转后拔出，接好种的蚕蛹用75%酒精消毒后放入培养器中盖好盖子送入暗室进行培养。

2.2大米及大米复合培养基接种

整个接种工作要在超净工作台无菌条件下进行。首先用75%的酒精擦拭超净工作台内部进行全面消毒，然后点亮酒精灯，并在靠近酒精灯的区域打开虫草培养瓶封口膜的一个小边角，迅速用无菌注射器吸取7～8 mL的液体菌种，均匀喷洒在培养瓶中，同时立即更换已经消过毒的塑料封口膜。整个接种动作要求迅速快捷，尽量减少杂菌污染。完成后，及时拿到已经灭菌的培养箱或培养室进行黑暗培养。

3　栽培管理

3.1菌丝培养期

栽培管理是决定虫草产量和质量的关键，蛹虫草在后期的各个发育阶段主要是受温度、湿度和光线三大因素的影响。蛹虫草喜中低温，在菌丝培养阶段，温度最好控制在19℃，这样可抑制杂菌发育。待蛹体周围、培养基料面布满白色绒毛状菌丝时将室温调到20～22℃继续培养。发菌阶段，室内湿度应该控制在65%～70%左右。虫草菌丝在黑暗中发育较快，因此虫草室的门窗必须进行遮光处理，保持黑暗。

在以上温湿度及光线条件下，蚕蛹经7～10 d感染菌液后硬化，约15 d左右在蚕蛹体侧的气门处可见白色菌丝出现，待白色菌丝布满蚕蛹表面时即可进入第二个培养阶段—转色催蕾期。大米培养基经过15 d培养，白色菌丝也会长满培养基即进入下一个培养阶段。

3.2转色催蕾期

白色菌丝体成熟后，要进行适当的光照和温差刺激才能形成培养原基。此时每天要进行感光，约12 h左右，白天可利用自然光，阴天或傍晚补充日光灯照射，光照强度为100～200 lx，晚上要尽量保持黑暗；白天室内温度控制在21℃左右，夜晚16℃左右；室内相对湿度控制在75%左右；这样经过3 d，菌丝体开始由白色变成淡黄色，7～10 d后，菌丝体逐渐变成桔黄色。转色后再培养1～3 d，待培养基表面长出许多圆丘状隆起—菌蕾，此时原基形成。

3.3出草管理期

这个阶段除了要控制好温度、湿度和光照，还要及时做好氧气补充工作。

1)温度:此时要形成子座，温度必须控制在20～23℃，超过25℃时则不能形成子座，这在用大米培养时表现更为明显。

2)湿度：子座生长阶段需要更多的水份，为了减少瓶内水分蒸发，培养室内要及时补充水分，以提高空气的相对湿度，室内相对温度要控制在80%～90%之间，但是湿度也不宜过大，超过95%时，霉菌等杂菌则容易繁殖。

3)光照：光照时间每天不能少于12 h。光照强度要在200 lx以上。由于蛹虫草具有较强的趋光性，在子实体形成后，要根据生长发育状况，及时调整培养瓶与光的方向，以保证子实体的良好形态，同时提高产量。

4)氧气补充：此期可通过在封口膜上扎孔透气给子实体补充氧气。在封口膜上扎上数个小孔及时给虫草补充氧气，这样培养7～10 d后，子实体就不再增粗增长，其顶端开始膨大，此时应适当延长光照时间，再经过2～5 d，蛹虫草顶端出现淡黄色的粉末状物体时，标志着虫草培养成熟，此时应及时采收。

3.4采收

蛹虫草成熟时颜色呈桔黄色，子实体头部膨大，表面有许多黄色粉状的子囊孢子出现时即为培养成熟。在采收时要戴上消毒好的无菌手套，用无菌镊子将虫草从培养器内小心的取出子实体，然后加少许营养液，重新包扎好瓶口，继续培养20 d左右，又可长出第二批子座。如果是用蚕蛹培养的子实体，则连同蚕蛹一同取出，保留子实体形状完好无损。

蛹虫草采收后，在通风阴凉处自然晾干，避免阳光直射，或用40℃以下低温烘干的方式进行干制。烘干后，蛹虫草的含水量一般在10%左右，按照质量等级进行分级包装即可。

4　小结与讨论

4.1虫草要获得高产收益，首先取决于菌种的选育。一是要早熟、高产，以降低生产成本，提高经济效益。二是要求菌种对昆虫的感染力强，能快速感染昆虫与培养基，提高成活率。三是对环境温度变化和其他杂菌感染要有一定的抵抗力。此外，如果长期采用无性繁殖或者多次转管获得的虫草菌种，它的母本优良特性很容易发生变异，在生产中培育的虫草子实体易畸形，产品质量、产量都会有很大程度的下降。因此在生产中要定期对选留的虫草菌种进行一次有性繁殖，以获得高质量的虫草菌种。

4.2近几年的培养对比试验表明，新鲜健康的鲜活蚕蛹是蛹虫草的理想培养基，但由于蚕蛹受养蚕季节、运输、家蚕蛹发育期短等因素的影响，再加上接种过程单一缓慢，要想实现其工业化生产难度很大；而用大米作培养基栽培蛹虫草效果好，添加了蚕蛹粉的大米培养基其菌丝生长迅速，子实体产生的时间早，生长周期短，成熟较快，生物转化率高，具有良好的发展前景。

4.3蚕蛹虫草大米虫草的人工栽培虽然已经获得成功，但在培养的过程中需要注意以下几个方面: ①虫草菌种的优良性状，存在着极大的遗传不稳定性，在多次转管繁殖后会出现不同程度的菌种退化，因此要定期进行一次有性繁殖，保持其优良性状，提高菌种质量；②接种完成后在发菌期，要保持低温18℃左右，以减少杂菌污染，提高接种成活率；③在培养原基形成时，一定要有适当的温差(5℃)刺激，只有经过温差刺激，原基才能正常分化；④在原基形成后，要采取补氧措施，及时在封口膜上扎孔，促使子实体正常生长；⑤子实体生长过程中，注意补湿，达到90%左右；⑥适时采收，否则子实体萎蔫影响虫草质量。

[1]朱雅红 桂仲争.蛹虫草液体菌种通气发酵培养及其营养成份分析[J].食品与生物技术学报,2009(9):699.

[2]孟楠,李亚洁,李学军,等.人工培育柞蚕虫草的研究[J].辽宁农业科学，2009(2):63-64.

Breeding Technology of Cordyceps Militaris and Rice Caterpillar Fungus

LU Jianzhen，WANG Jianwei，LIU Youzhi，LI Shufang

(Shanxi Provincial Sericultural Institute, 044000,Yuncheng ,Shanxi, China)

The superior mother seed was acquired through selection, introduction of high quality mother seed, and roll tube culture.Then it was produced into liquid spawn and inoculated into the cultures of chrysalis and rice plus pupa powder.The three major periods, namely, mycelium culture, veraison and bud pressing, and fruit body management, were studied and summarized on the culture conditions and key technologies.

Cordyceps Militaris; Rice Caterpillar Fungus; liquid spawn; rice culture; breeding technology

卢建珍(1970—)，女，农艺师，从事家蚕繁育及蛹虫草培育研究。

* 资助项目：现代农业产业技术体系建设专项(CARS-22)；山西省商务厅茧丝绸风险基金项目(2015)