土壤中固氮菌的分离纯化与性质鉴定

付 斌（齐齐哈尔市环境监测中心站 黑龙江 齐齐哈尔 161000）

土壤中固氮菌的分离纯化与性质鉴定

付 斌（齐齐哈尔市环境监测中心站 黑龙江 齐齐哈尔 161000）

采用阿斯贝培养基进行菌种分离纯化，再通过吲哚试验、糖发酵试验等9个试验对其进行生理生化鉴定，最终得到一株革兰氏阴性，无芽孢的短杆状固氮菌。试验为微生物固氮菌肥生产中菌种的筛选提供参考，为商业化生产优质的生物固氮菌肥提供基础。

固氮菌；阿斯贝培养基；分离纯化；鉴定

1 前言

氮是植物生长不可缺少的“维生素”，是合成蛋白质的主要来源。在空气中约有80%的氮气以游离状态存在，不能为生物体直接利用。而固氮菌能通过其体内固氮酶的作用，把空气中植物无法吸收的氮气转化成氨态氮固定下来，成为植物可以直接利用的氮肥。

固氮菌肥的作用效果和生态效益是化学肥料所不具备的。施用固氮菌肥，能有效的提高土壤的有效氮素，增加农作物产量。固氮菌除能固氮之外，还能形成维生素和异生长素，不仅能够刺激农作物生长发育，还可以加强其他根际微生物的生命活动，促进土壤有机物质的矿化作用，改良土壤结构，改善农作物品质。加强土壤固氮菌的筛选、驯化、应用研究，对于减少化肥的使用量，提高农业的可持续发展，改良土壤，改善环境具有重大意义。

2 材料与方法

2.1 试验材料

（1）菌株来源

本试验筛选菌株土壤来源于克山县大豆种植农田。

（2）培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g；蛋白胨10g；氯化钠5g；琼脂20g；蒸馏水1000ml。121℃灭菌20min。

阿斯贝无氮培养基：葡萄糖 1%；磷酸氢二钾 0.02%；氯化钠 0.02%；一水硫酸镁 0.02%；硫酸钾 0.02%；碳酸钙 0.5%；琼脂 1.5%～2.0%；蒸馏水；112℃灭菌20min。

生理生化鉴定培养基：不同浓度的氯化钠培养基、明胶液化培养基、甲基红液体培养基、伏-普培养基、吲哚培养基、苯丙氨酸脱氢酶培养基、硝酸盐还原培养基、柠檬酸盐培养基，葡萄糖氧化发酵液体培养基，配制方法详见参考文献。

2.2 仪器设备

表1 试验所用仪器设备简介

2.3 试验方法

2.3.1 菌种采集

称取10g土壤，溶于90ml无菌水中，置于摇床中37℃振荡25min，静置备用。

2.3.2 固氮菌的分离

将各稀释倍数的菌液涂布于阿斯贝无氮培养基上，每个梯度三个平行样品。将各平板置于37℃培养箱中培养24h。

2.3.3 固氮菌的纯化

观察菌落形态，挑取不同形态的单个纯菌落，在阿斯贝无氮培养基上进行多次三区划线分离，确定为纯菌株后，接种保存。

2.3.4 固氮菌的鉴定

（1）菌落形态观察。观察菌落形态，记录菌落的形状，颜色，边缘，表面，干燥或湿润，隆起状况及透明度。对菌体进行革兰氏染色，观察结果，并测定菌体大小。

（2）生理生化鉴定试验。对菌体进行柠檬酸盐试验、葡萄糖发酵试验、甲基红试验、伏-普试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、苯丙氨酸脱氢酶试验、明胶液化试验和不同浓度的氯化钠试验。

3 结果与讨论

3.1 菌落形态观察

用阿斯贝培养基从土壤中分离出来的菌种，其菌落形态为：圆形、无色、边缘整齐、表面光滑、湿润、凸起，透明。见图1。

图1 阿斯贝培养基上分离纯化出的固氮菌

3.2 革兰氏染色结果

对分离纯化后的菌种进行革兰氏染色，干燥后，在光学显微镜下观察。观察结果为：革兰氏阴性，杆状，菌体大小为（1～2）×（2～6）μm，但菌体自身不着色。

图2 革兰氏染色结果

3.3 生理生化鉴定结果

表2 试验菌株的生理生化鉴定结果

表3 需氧和厌氧条件下葡萄糖发酵试验结果

4 结论

本试验从大豆农田土壤中成功分离出一株固氮菌，其菌株特性为：革兰氏阴性，无芽孢，短杆状细菌。其菌落形态为：圆形、无色、边缘圆滑、表面光滑、湿润 、突起、透明。该菌在低盐浓度下生长；不能使明胶液化；不能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚；有硝酸盐还原作用；伏-普反应阴性；甲基红反应阳性；苯丙氨酸脱氢酶反应阴性；柠檬酸盐反应阴性；在厌氧条件下，不利用葡萄糖，不产酸也不产气；在有氧条件下，利用葡萄糖，产酸不产气。

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〔8〕沈萍，范秀荣，李广武.微生物学实验.第三版.北京：高等教育出版社，1999：26～28.

Isolation，purification and property identification of Azotobacter in the soil

FuBin（Environment Monitoring Center Station of Qiqihaer City Qiqihaer HeiLongjiang 161005）

In this experimentation，Ashby medium was used to seperate and purify the strains，and through a series of laboratory experiments，such as indol test，suger fermentation test and other seven tests the strains were identified.At last，a G-and non-sporiferous bacillus was got.This experimentation is good for screening out the Azotobacter from the bacteria manure，and it is also the basis of producing the high quality nitrogenfixing bacteria manure.

Azotobacter Ashby medium Seperation and Purification Identification

X53

A

1674-263X（2016）01-0017-03

2016-02-12

付斌（1983-），女，硕士，工程师，从事环境监测工作。