基于微流控技术的营养盐原位分析方法的研究*

马 然，曹 煊，刘 岩，张述伟，王小红，张天鹏

（1.山东省科学院海洋仪器仪表研究所，山东青岛266100；2.山东省海洋环境监测技术重点实验室，山东青岛，266100）

基于微流控技术的营养盐原位分析方法的研究*

马 然1，2*，曹 煊1，2，刘 岩1，2，张述伟1，2，王小红1，2，张天鹏1，2

（1.山东省科学院海洋仪器仪表研究所，山东青岛266100；2.山东省海洋环境监测技术重点实验室，山东青岛，266100）

现有国内的营养盐监测手段主要采用岸边在线监测或现场取样+实验室分析，不能实现原位长期监测，因此无法反映较远海域的营养盐参数变化趋势。为此，提出一种可用于原位监测营养盐参数的微缩实验室方法，采用微流控技术+光电检测技术，依据信号锁相放大原理，实时分析水样的吸光度，最终实现营养盐的原位监测。长期的海试数据与实验室数据的比对结果证明了该方法的可行性。本文提出的分析方法的实现对于海洋富养化生态灾害的监测具有非常重要的意义，也对保护海洋生态环境的健康提供技术支撑。

海洋环境监测；营养盐原位分析；微流控技术；锁相放大；吸光度

常规的营养盐参数包括：硅酸盐、磷酸盐、氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐共五项，它们是海水中微生物所必须的营养元素，也是海洋生态环境监测的重要参数之一［1-2］。分析海水中营养盐浓度的变化，对于监测海洋环境、预警海洋生态灾害等具有重要的意义［3-4］。目前，海水营养盐的监测方法主要是根据海洋监测规范（GB 17378—2007），规范中采用的是现场采样-实验室测定法［5］。该方法技术成熟、测定可靠，但存在实时性差、水样易受污染、浪费人力物力等缺点。而海洋原位监测一般采用浮标定点长期监测，浮标监测体系对功耗、体积和可维护性都有很高的要求，以目前国内现有的监测手段难以实现［6］。因此，针对原位营养盐传感器的研发成为海洋生态环境监测领域的研究热点之一。

基于此，本文提出一种针对海洋原位营养盐监测的方法，采用微流控技术，测定并依据海水试样吸光度的变化确定其营养盐的含量，具备功耗低、体积小、试剂量少、可靠性高、原位运行时间长等特点。

1 海水营养盐原位分析方法的国内外现状介绍

在流路体系中通过设计合理的流体及显色反应控制装置，精确地控制试剂与水样的混合时间并实现显色反应的过程，是海水营养盐原位监测技术的核心所在。

国际上比较知名的海水营养盐原位监测仪器包括：意大利SYSTEA公司的WIZ系列营养盐在线监测仪，美国Envirotech公司的MicroLAB和EcoLAB系列营养盐原位监测系统，美国SubChem Systems，Inc.公司的 APNA（Autonomous Profiling Nutrient Analyser）营养盐分析系统等。

其中WIZ Pro目前在国内的市场占有率较高，WIZ Pro是一款便携式野外在线传感器，可用于地表水及海洋水中最多达四个化学参数的自动化测量。WIZ主要采用业内公认的分光光度湿化学法进行测量，氨氮的检测采用荧光法，该系统的亮点在于——微环流反应体系使得试剂及校准液的消耗量降到最低，采用与业内常规水质分析仪相同的单筒型设计使得投放和安装简便易行。不过该系统的缺点是采用单通道测量，反应速度较慢，目前国内的主要应用在湖泊、河流等淡水区域监测，国内海洋环境的应用相对较少。

EcoLAB多通道营养盐分析仪能够在整个水样中进行单独的化学反应，反应所使用的分析方法专门用于长期的现场监测和不连续分析。该系统能够分析1到4个营养盐通道，包含硝酸盐、磷酸盐、氨氮、硅酸盐。该分析仪对生物污损有非常强的抵抗力，在水下工作时中可进行常规的校准和自我清洁，额定工作水深可达4 000 m，适合深远海的营养盐测量。

APNA是一套快速响应的自记式水下营养盐分析系统，设计专门应用于营养盐及其它重要环境化学要素的高分辨率、自记式定点长期或现场剖面监测。APNA系统主要由两个模块构成：①采样、试剂输送和WET Labs的多通道吸收光/荧光检测器“ChemStar”单元；②试剂和标准溶液存放单元。APNA采用连续流动分析方法，实现现场快速读取硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐、硅酸盐和氨氮等几项营养盐的浓度。APNA反应速度快，但试剂消耗量较大，更适合做深海剖面营养盐的测量。

由于国内营养盐自动化分析技术起步较晚，现有产品化应用的海水营养盐分析仪器依然停留在现场分析阶段，其中以国家海洋技术中心杜军兰老师团队研发的营养盐在线分析仪为代表。该分析仪采用单参数单通道分析，其流体及显色反应控制装置多为单通道分散式结构，每一个营养盐参数对应一个通道，每个通道均需流体控制装置、混合反应器、蠕动泵、自动进样阀和光学流通池。这种方法的优点是测量速度快（约20 min）、准确度高、技术成熟可靠，缺点是集成度低、体积大、能耗高、试剂用量大等不足，不便于进行原位测量［9-11］。而且采用现场分析方法对于近海海域监测只能采用走航式测量或岸站式测量，走航式测量的成本太高且无法进行长期连续监测，岸站式测量对于稍远的海域无法监测。

因此，如何实现长期稳定、体积小、功耗低的海水营养盐原位分析方法的国产化应用，是目前亟待解决的问题。

微流控技术是一种新兴的精确控制和操控微尺度流体的技术［12］。在20世纪80年代，微流控技术开始兴起，并在DNA芯片，芯片实验室，微进样技术，微热力学技术等方向得到了发展［13］。微流控技术有着体积轻巧、使用样品及试剂量少等优点。在生物、化学、医学等领域有着的巨大潜力，近年来已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域［14-16］。因此，采用微流控技术可以完美地解决现有技术手段无法解决的体积和功耗方面的问题。

基于此，本文提出基于微流控技术的海水营养盐原位分析方法，核心元器件采用自主加工的200 μm通径流路的微流控芯片与微型三通阀组形成阀岛体系，若按照程序固定顺序切换阀组通断以及调整微型泵转速，在一块微流控芯片中就可实现5项营养盐参数流路的依次切换，大大节省了流路空间，而且由于流路的长度固定，试剂量也可以实现μg级的精确控制［17］。

2 海水营养盐原位分析系统的设计

2.1 海水营养盐原位分析方法的整体研究方案

有了先进的微流控技术支持，还需要合理的研究方案配合，才能实现稳定可靠的营养盐原位分析方法。本文提出的研究方案主要针对体系的可靠性、稳定性、灵敏度问题，从硬件体系到软件算法两个大方向进行研究。具体的研究方案如图1所示。

图1 总体研究方案

2.2 硬件体系可靠性、稳定性保障的相关研究

2.2.1 流程时序的精确控制与元器件选型

流路体系的可靠性关键在于对溶液流量的精确控制。本文提出的基于微流控芯片技术的阀岛体系，采用微流控技术的微型三通电磁阀组和0.1 rad/min精度步长的微型蠕动泵，可以克服现有流体及显色反应控制装置体积庞大、功耗大的问题，降低能耗、缩小体积、减小试剂用量、提高集成度。

微流控芯片由上下两层板组成，材料为有机玻璃，可提高耐酸碱、高盐等的腐蚀性，两层有机玻璃板通过丙酮有机试剂黏结、热压等方式封装，形成一块完好的微流控芯片。芯片集成多个电磁阀、水样、纯水、多种显色剂的流体入口及出口，对于盖板和底板的流通槽的加工精度要达到10 μm，才能保证100 μm的尺寸精度。

同时，针对硅酸盐、磷酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐4项参数本文采用环流分析-分光光度测定技术。环流分析的优势在于，可以针对溶液、试剂进行定量混合稀释，提高测量的精度。通过泵阀切换将海水和指示剂分别抽取到定量环中，再将充满海水样品和指示剂的两个定量环连接起来形成闭合环路实现样品和试剂以指定的比例混合进行反应；待反应充分后，开启对应窄带波长LED，光电二极管会检测到在十字型流通池中混合指示剂的水样吸光度；最后通过光纤耦合和滤光片滤光的方式实现多波长检测，光路设计上采用三进二出的光纤耦合装置，将每一路光路分为两路，其中一路作为主信号，另一路作为参比信号以此消除入射光不稳定的影响，其他2路利用测得的吸光度的数据计算得到每项营养盐参数［18-19］。微流控体系流程控制的原理如图2所示。

图2 微流控芯片环流分析原理

2.2.2 光电检测及控制体系的设计

电路系统采用模块化设计，包括电源模块，核心模块，控制模块，光源输出模块，微光信号采集模块，数据存储模块，通信模块。电路系统的设计框图如图3所示。

为保证最终传感器可以长期在水下工作，体系采用12 V电池电源供电，经电源管理模块稳压处理及分压后供给其他功能模块。核心处理器选用32 bit ARM芯片作为MCU主控单元，控制泵、阀、光源按照固定的流程时序运行，同时负责信号的采处理。

控制模块主要实现对微型蠕动泵及三通阀组的控制，根据设计原理依据设定的时序进程混合试剂与水样，或切换流路。

光源输出模块主要实现对LED光源的控制，通过LED专用恒流基准源提供恒定电流激励LED光源发光，并采用光路耦合器将三路光耦合为二路光，通过粗细不同的两根光纤将光信号传导至光电二极管。

微光信号采集模块通过对前置光电二极管采集到的微弱电压信号进行前置滤波、可编程放大及16 bit AD转换转化为数字信号，进而在MCU中进一步数据平滑滤波处理。处理后的数据按照固定加密格式存储于片上Flash中，并可以通过RS232串口格式传输至上位机。

图3 电路设计原理

2.3 信号准确度保障的相关研究

2.3.1 信号处理电路的设计

为了提高对检测信号采集的准确性，本文在微光信号采集模块中优选设计锁相放大电路、可编程增益放大器和四阶滤波电路A/D转换器，原理如图4所示。光电二极管检测到通过谐振器提供的1 kHz固定频率LED光信号，经由同频率的锁相放大器进行信号识别和波形整形处理后，输出至可编程增益放大器PGA进行二阶信号放大处理［20］。

放大后的信号必然会混入一些白噪声，因此需要增加四阶带通滤波器进行信号滤波［21］。传输至16 bit精度A/D转换器将模拟信号转换成数字信号后，发送至MCU。为了提高转换精度，A/D转换器优选采用16 bit A/D转换器，以转换生成16 bit数字信号输出至主处理器MCU作进一步数据平滑滤波处理。

图4 电路设计原理

对于硬件信号处理后的数据，主处理器MCU按照固定的加密格式存储于微光信号检测装置中的存储模块中，例如可以通过主处理器MCU的SPI接口经由锁存电路写入FLASH存储器中，以便于主处理器MCU后续滤波处理；同时MCU可以通过通信模块上传至上位机，进行长期数据监控分析。

2.3.2 低通滤波算法的设计

众所周知，所有的滤波算法无法完美地兼顾灵敏度和平稳度，因此只能寻找一个平衡，在可接受的灵敏度范围内取得尽可能好的平稳度［22］。当数据快速变化时，滤波结果能及时跟进（灵敏度优先）；而当数据趋于稳定，在一个固定的点上下振荡时，滤波结果能趋于平稳（平稳度优先）。

为减少MCU的运算量，本文采用一阶低通滤波算法，算法公式为：

式中：A表示一阶滤波系数（整型数据）；X(n)表示本次采样值；Y(n-1)表示上次滤波输出值；Y(n)表示本次滤波输出值。一阶低通滤波算法采用本次采样值与上次滤波输出值进行加权，得到有效滤波值，使得输出对输入有反馈作用。

公式对于没有乘/除法指令的MCU来说，需要用循环加/减法来实现乘/除法运算。而过多次数乘/除法运算会增加系统的运算量，影响效率。为了提高MCU的运算速度，需将公式进行简化。基于此，提出一种可自动识别的算法，效率提高了一倍。算法如下：

①如果X（n）＜Y（n-1）：

②如果X（n）＜Y（n-1）：

说明：一阶滤波系数A取值范围0～255；该系数的大小决定X（n）在本次滤波结果中所占的权重，A值按以下动态调整算法在程序中可实现自动计算。

动态调整算法的流程如图5所示，其原理如下：①当两次数据变化方向不一致时，说明有抖动，将滤波系数清零，忽略本次新采样值；②当数据持续向一个方向变化时，逐渐提高滤波系数，提过本次新采样值的权；③当数据变化较快时，要加速提高滤波系数。

图5 一阶滤波系数动态调整算法流程

3 海试试验数据分析

将海水营养盐原位分析系统放置于岸边浮标长期监测营养盐数据，并通过统计分析对海水营养盐趋势变化进行性能评价，实验结果将与岸边实验室的比测数据进行对比，比对方法如下：在浮标上对海水营养盐原位传感器的实时数据进行采集及记录，并采集相对应时间的水样，在实验室依据国标GB 17378.42007规定的检测方法，利用比测设备对水样进行测试，将所得数据与海水营养盐原位传感器同一个时次的数据进行比对，计算其差值，考察数据的准确性，比测时长1个月，每日9：00比测一次，15：00比测一次，共计60次。比对分析方法如表1所示。

表1 海水营养盐原位比对分析方法

比测结束后，将浮标在线监测系统原始数据与实验室检测数据进行比较，绘制趋势图如图6所示，图6中纵坐标单位为“μg/L”，横坐标单位为“次”，M线为原位监测系统测得的实时数据，L线为实验室检测数据。通过观察曲线图谱，可得出如下结论：①硅酸盐：两者数据吻合度一般，两者趋势基本一致，数据较为稳定；②磷酸盐：两者数据趋势基本吻合，但数据波动略大，两者变化趋势相对一致；③亚硝酸盐：两者数据较为吻合，变化趋势相对一致；④硝酸盐：两者数据基本吻合，变化趋势基本一致；⑤氨氮：两者数据较为吻合，变化趋势基本一致。

图6 一个月周期比对数据图

4 结语

本文对于海水营养盐原位分析提出一种新的方法，能实时反映海洋环境的综合影响，弥补了现有在线监测方法的不足，符合中国海域环境监测的实际需求，有助于更加全面、客观、及时地掌握海洋环境的动态变化特征。通过比对实验的数据证明，采用微流控技术的海水原位营养盐分析方法是一种可靠、稳定的方案，尤其适用于浮标体系的长期监测，可以实现对海洋环境进行连续监测以及对近岸海洋环境污染的预警，为海洋环境的监管以及污染防治提供全面可靠地依据。

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马 然（1982-），男，山东省科学院海洋仪器仪表研究所，硕士学位，助理研究员，主要从事海洋环境监测技术研究，mr47@sohu.com。

The Research of Nutrients in Situ Analysis Method Based on Microfluidic Technology*

MA Ran1，2，CAO Xuan1，2，LIU Yan1，2，ZHANG Shuwei1，2，WANG Xiaohong1，2，ZHANG Tianpeng1，2
（1.Institute of Oceanographic Instrument，Shandong Academy of Science，Qingdao Shandong 266001，China；2.Shandong Ocean Environment Monitoring Technology Key Laboratory，Qingdao Shandong 266001，China）

The existing domestic nutrient monitoring method mainly adopts the shore on-line monitoring or field sampling&laboratory analysis，it can't realize the in situ monitoring for a long time.Therefore the domestic equip⁃ment are failed to reflect the nutrient parameters trend of change of distant sea.To this end，this paper proposes a miniature laboratory methods can be used for nutrient parameters monitoring in situ.Using microfluidic technology &photoelectric detection technology，according to the signal phase lock amplifying principle，real-time analysing water absorbance，finally realized the in-situ monitoring of nutrient.The long-term comparing results of sea trial da⁃ta and laboratory data prove the feasibility of this method.The implementation of the monitoring method put forward by this paper has very important significance for eutrophic ecological disaster early warning about the ocean，which also provides technical support to protect the health of the marine ecological environment.

the marine environment monitoring；nutrients in-situ analysis；microfluidic technology；phase-locked amplifier；absorbance

TP391.8；X853

A

1004-1699（2016）11-1659-07

EEACC：7230 10.3969/j.issn.1004-1699.2016.11.006

项目来源：国家自然科学基金资质项目（41206076）；山东省自然科学基金资质项目（ZR2014YL006）；青岛市战略性新兴产业培育计划项目（14-9-1-2-hy）

2016-05-25 修改日期：2016-07-06