GnIH在陆川仔公猪泌尿生殖系统及内分泌免疫系统中的分布

霍孔林，李 昀，王晓晔，胡 浩，李建华，李 珣，2

(1 广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530004；2 广西理工科学实验中心，广西 南宁 530004)



GnIH在陆川仔公猪泌尿生殖系统及内分泌免疫系统中的分布

霍孔林1，李 昀1，王晓晔1，胡 浩1，李建华1，李 珣1，2

(1 广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530004；2 广西理工科学实验中心，广西 南宁 530004)

【目的】 从形态学水平和分子水平探究促性腺激素抑制激素(GnIH)在陆川仔公猪泌尿生殖系统和内分泌免疫系统中的分布情况。【方法】 采集30日龄健康陆川仔公猪的睾丸、附睾、附睾管、肾、肾上腺、甲状腺、腭扁桃体、脾、淋巴结、胸腺，采用免疫组织化学和半定量RT-PCR的方法检测GnIH在其泌尿生殖系统和内分泌免疫系统的分布情况。【结果】 免疫组织化学分析结果显示，在睾丸、附睾、附睾管、肾、肾上腺、甲状腺、腭扁桃体、脾、淋巴结、胸腺均有不同数量的GnIH免疫阳性细胞分布。半定量RT-PCR的检测显示，GnIHmRNA 除了在甲状腺、脾和淋巴结无表达外，在其余组织均有不同程度的表达。【结论】 GnIH在泌尿生殖系统和内分泌免疫系统分布广泛，提示GnIH在生殖、免疫和内分泌等生理过程中可能有重要作用。

GnIH；陆川仔公猪；免疫组织化学；半定量RT-PCR

日本科学家Tsutsui等[1]2000年发现，在鹌鹑的下丘脑中有一种能控制促性腺激素释放的物质，这一物质被命名为促性腺激素抑制激素(Gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH)，其由GnIH前体肽裂解产生，是一种C末端具有LPXRF(X=L或R)酰胺的结构。目前已经证明，GnIH存在于多种动物，如鸟类[1-4]、哺乳类[5-7]、两栖类[8]和鱼类[9]中。GnIH除了参与生殖调控外，还具有调节动物摄食、性行为及影响内分泌、应激等广泛的生物学作用[10-11]。陆川猪是全国八大地方优良猪品种之一，具有成熟早、遗传力稳定和繁殖力高等诸多优点。GnIH作为动物生殖调控的关键因子，研究其对陆川猪有何种生理功能具有非常重要的生产应用和理论研究价值。本试验采用免疫组织化学和半定量RT-PCR的方法，研究了GnIH在陆川仔公猪泌尿生殖系统和内分泌免疫系统中的分布定位，以期为全面深入研究GnIH调控动物生殖、内分泌等生理功能提供形态学资料和分子理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂 即用型SABC免疫组化染色试剂盒(羊抗兔)和DAB显色试剂盒，均购于武汉博士德生物工程有限公司；兔抗猪GnIH，广西大学动物科学技术学院实验室自备抗体；琼脂糖，购于南京生兴生物技术有限公司；Trizol、RNA反转录酶、DNA Marker(DL2000)和Golden View核酸染料，均购于南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.1.2 供试动物 6头30日龄健康陆川仔公猪由广西畜牧研究所地方猪种活体基因库赠送，其中3头颈动脉放血致死后，迅速取出睾丸、附睾、附睾管、肾、肾上腺、甲状腺、腭扁桃体、脾、淋巴结、胸腺放入液氮中速冻后转入-70 ℃保存，用于半定量RT-PCR。另外3头用速眠新麻醉后切开颈部皮肤，分离两侧颈动脉和颈静脉，将一侧颈动脉切开，从另一侧颈静脉灌注生理盐水，待动脉侧流出液体较清亮时，开始灌注体积分数4%多聚甲醛溶液至全身肌肉僵硬，取与半定量RT-PCR相同的组织，放入体积分数4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，常规脱水透明，石蜡包埋，切片(厚5 μm)，贴附于玻片，常温干燥过夜后置于-20 ℃保存，用于免疫组织化学分析。

1.2 免疫组织化学分析

采用常规方法对切片进行脱蜡后，置微波炉中进行抗原热修复；浸泡于体积分数3% H2O230 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次；滴加正常兔血清封闭液，室温30 min，甩去多余液体；滴加一抗GnIH(稀释度1∶200)，4 ℃过夜，37 ℃复温1 h，PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗(生物素化羊抗兔IgG)，37 ℃ 30 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加DAB，室温显色5 min；蒸馏水使反应终止；苏木精复染15 s，封片。阴性对照：用PBS代替一抗，其他步骤不变。在普通光学显微镜下进行观察，选取背景清晰、细胞胞体呈棕黄色-棕褐色颗粒且具有典型代表性的免疫阳性细胞进行拍照分析。

1.3 半定量RT-PCR扩增

在无RNA酶的环境中按照Trizol试剂的说明书提取总RNA。cDNA的合成采用vazyme试剂盒一步反转录法进行，20 μL的RT反应体系包括2×RT Mix 10 μL、HiScript 2 μL、Oligo dT181 μL、总RNA 7 μL；混合后置于50 ℃水浴45 min，RT产物置-20 ℃保存待用。选取GAPDH为内源性参照基因，检测猪GnIHmRNA在不同组织中的表达情况。根据NCBI已登录的牛、羊GnIH序列(牛、羊的GnIHGenBank ID分别为EF494241、NM174168.1)中同源性较高的部分设计引物,其序列如下：GnIH-1.5′-TAA CAT CCA ACA TCT- TTT GTA CAG-3′，GnIH-2.5′-CGG GTG ATG- GAG TAA AGT AAC-3′,扩增GnIH基因的片段长度为442 bp；GAPDH-1.5′-AGG TCG GAG- TGA ACG GAT TTG-3′,GAPDH-2.5′-CAG- TCT TCT GGG TGG CAG TGA T-3′,扩增GAPDH基因的片段长度为549 bp。PCR程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，退火30 s(GnIH退火温度56 ℃，GAPDH退火温度57 ℃)，72 ℃延伸30 s，适当循环(GnIH48个循环，GAPDH42个循环)；72 ℃延伸10 min后终止反应。PCR完成后，用2.0%的琼脂糖凝胶电泳分析结果。

2 结果与分析

2.1 GnIH免疫组织化学结果

2.1.1 在生殖系统和泌尿系统的分布定位 在睾丸的生精小管内，GnIH阳性细胞多且排列紧密，多数围绕在生精小管边缘部，睾丸间质也有数量较多的GnIH免疫阳性细胞，呈簇状分布(图1-A)。在附睾中，GnIH免疫阳性细胞分布于结缔组织部、输出小管及附睾管，结缔组织中GnIH免疫阳性细胞数量不多，呈团状分布，输出小管边缘GnIH免疫阳性细胞分布较多且排列紧密(图1-B)；在附睾管中，GnIH免疫阳性细胞紧密排列在附睾管外周，发育后期附睾管上GnIH免疫阳性反应较发育前期弱，其间质也有数量较多的GnIH免疫阳性细胞，呈梭状，紧密围绕附睾管(图1-C)。在肾中，肾小体、肾放线和皮质迷路均呈中等GnIH免疫阳性反应(图1-D)。在对照组试验中，睾丸、附睾、附睾管和肾中均无棕黄色-棕褐色颗粒，呈阴性(图1-A1～D1)。

A～J.分别为试验组睾丸、附睾、附睾管、肾、肾上腺、甲状腺、腭扁桃体、脾、淋巴结、胸腺;A1～J1.分别为对照组睾丸、附睾、附睾管、肾、肾上腺、甲状腺、腭扁桃体、脾、淋巴结、胸腺；箭头所示为GnIH免疫阳性细胞。

图 1 GnIH在陆川仔公猪泌尿生殖系统及内分泌免疫系统中的分布定位

Fig.1 Distribution of GnIH in urinary,reproductive,endocrine and immune systems of the Luchuan male piglets

2.1.2 在内分泌系统和免疫系统的分布定位 GnIH免疫阳性反应细胞在肾上腺、甲状腺、腭扁桃体、脾、淋巴结和胸腺中均有分布。肾上腺皮质和髓质均有中等程度GnIH免疫阳性反应细胞(图1-E)。甲状腺滤泡旁细胞呈中等GnIH免疫阳性反应，而滤泡细胞呈GnIH免疫反应强阳性(图1-F)。腭扁桃体复层扁平上皮、弥散篱笆组织及淋巴小结均呈较强的GnIH免疫阳性反应(图1-G)。脾脏红髓和白髓均有较强的GnIH免疫阳性反应，红髓中GnIH免疫阳性细胞呈团块状分布，白髓中GnIH免疫阳性细胞主要分布于动脉周围淋巴鞘(图1-H)。在淋巴结中，浅层皮质里的小结间弥散淋巴组织和副皮质区均呈现中等GnIH免疫阳性反应(图1-I)。胸腺的髓质中有数量较多的GnIH免疫反应强阳性细胞(图1-J)。在对照组试验中，肾上腺、甲状腺、腭扁桃体、脾、淋巴结和胸腺中均无棕黄色-棕褐色颗粒，呈阴性(图1-E1～J1)。

2.2GnIHmRNA表达情况

半定量RT-PCR结果(图2)显示，GnIHmRNA在睾丸、肾、肾上腺的表达量较高，附睾、腭扁桃体、胸腺呈中等程度表达，在甲状腺、脾和淋巴结几乎无表达。

A.GAPDH mRNA半定量RT-PCR电泳图；B.GnIH mRNA半定量RT-PCR电泳图。

图 2GnIHmRNA在陆川仔公猪泌尿生殖系统和内分泌免疫系统中的表达情况

Fig.2 Statistical analysis ofGnIHmRNA expression in urinary,reproductive,endocrine and immune systems of Luchuan male piglets

3 讨 论

在动物生产的过程中，繁殖能力的高低是决定其经济效益的重要因素。而越来越多的试验结果表明，GnIH作为生殖调控的关键因子，对调节促性腺激素的分泌和合成有重要的作用[12-13]，所以深入研究其生理功能是很有必要的。在禽类中，GnIH和GnIH-R在睾丸中都有表达[14]，提示在禽类生殖细胞的分化过程中有GnIH的参与。笔者曾研究了GnIH在母猪HPG轴中的分布和生理周期变化，发现GnIH及其受体GPR147在HPG轴均有分布，且在生殖周期中的表达呈现规律性的波动[15]。有研究表明，GnIH可能是以负反馈调节机制影响了生殖系统中性激素的分泌[16-17]，也有研究表明GnIH有可能是通过旁分泌或自分泌进而影响了HPG轴中性激素的分泌[18]。Zhao等[19]的研究发现，在叙利亚仓鼠的睾丸间质细胞、精原细胞和精母细胞中均有GnIH的分布，这与本研究的结果一致。郑路程等[20]研究发现，不同日龄的公猪其GnIH免疫阳性神经元的数量和GnIHmRNA的表达量在HPG轴呈规律性的变化，表明GnIH可能对猪的性行为会产生重要的影响。本研究除印证了GnIH在睾丸的分布外，还发现在发育后期附睾管上GnIH免疫阳性反应较发育前期弱，提示GnIH对附睾管的生长发育或者对其营养精子的功能起到了关键的作用。

此外笔者发现，在肾上腺的皮质和髓质部位有GnIH的分布，提示它可能参与了激素生成和分泌的生理过程；在甲状腺中，其滤泡旁细胞和滤泡细胞有GnIH免疫阳性反应，而GnIHmRNA无表达，这提示GnIH是通过旁分泌进而影响甲状腺的生成或分泌的；在免疫系统中，GnIH免疫阳性细胞在脾(红髓、白髓)，腭扁桃体(复层扁平上皮、弥散篱笆组织及淋巴小结)，淋巴结(浅层皮质里的小结间弥散淋巴组织和副皮质区)均有分布，提示GnIH同时也参与了免疫生理过程。在肾中，肾小体、肾放线和皮质迷路有GnIH免疫阳性反应，且GnIHmRNA的表达量较高,则提示GnIH可能在参与维持体液和电解质的平衡中起到了重要作用。

本研究结果为GnIH在泌尿生殖系统、内分泌免疫系统的分布定位提供了直观的形态学资料和分子理论依据，但其具体的生理调控机制仍需做更深入的研究。

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Distribution of gonadotropin-inhibitory hormone (GnIH) in urinary,reproductive,endocrine and immune systems of Luchuan male piglets

HUO Konglin1,LI Yun1,WANG Xiaoye1,HU Hao1,LI Jianhua1,LI Xun1，2

(1 College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi 530004,China；2GuangxiExperimentCentreofScienceandTechnology，Nanning,Guangxi530004,China)

【Objective】 This study analyzed the distribution of GnIH in urinary,reproductive,endocrine and immune systems of the Luchuan male piglets from the morphology and molecular levels.【Method】 Testis,epididymis,ductus epididymis,kidney,adrenal gland,thyroid gland,palatine tonsil,spleen,lymph gland and thymus tissue of 30 d old healthy male piglets were collected,and immuhischemistry (IHC) and semi-quantitative RT-PCR were used to study the distribution and expression of GnIH in urinary,reproductive,endocrine and immune systems.【Result】 IHC results showed that GnIH immune positive cells distributed in testis,epididymis,ductus epididymis,kidney,adrenal gland, thyroid gland,palatine tonsil,spleen,lymph node,and thymus.The results of semi-quantitative RT-PCR suggested that GnIH mRNA expression in all tissues except for thyroid gland,spleen and lymph node.【Conclusion】 GnIH widely distributes in urinary,reproductive,endocrine and immune systems,indicating that GnIH may play an important role in many physiological processes,such as reproduction,immune and endocrine.

GnIH;Luchuan male piglets;IHC;semi-quantitative RT-PCR

时间:2016-10-20 16:36

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.12.003

2015-07-06

“大学生创新创业训练计划”国家级创新训练项目(141059332)；广西大学基金项目(XJZ14307)；国家自然科学基金青年科学基金项目(31402151)；广西理工科学实验中心项目(KTYX2014007)

霍孔林(1993-)男，广西藤县人，本科在读，主要从事动物神经内分泌研究。E-mail:429871905@qq.com

李 珣(1985-),女，广西桂林人，讲师，博士，硕士生导师，主要从事动物神经内分泌研究。 E-mail:lixun198@163.com

S828.1

A

1671-9387(2016)12-0016-05

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161020.1636.006.html