青连宁心胶囊的质量标准研究Δ

司席席，孙洪胜，曹广尚，陈倩倩，刘 丹（.山东中医药大学药学院，济南 50355；.山东中医药大学附属医院，济南 500）

青连宁心胶囊的质量标准研究Δ

司席席1＊，孙洪胜2#，曹广尚2，陈倩倩1，刘 丹1（1.山东中医药大学药学院，济南 250355；2.山东中医药大学附属医院，济南 250011）

目的：建立青连宁心胶囊的质量标准。方法：采用薄层色谱法（TLC）对制剂中黄连、青蒿进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定制剂中青蒿素的含量：色谱柱为Diamonsil C18，流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液（45∶55，V/V），流速为1.0 ml/min，检测波长为260 nm，柱温为30℃，进样量为10 μl。结果：黄连、青蒿的TLC斑点清晰，分离度好，阴性对照无干扰。青蒿素检测质量浓度线性范围为5.62～56.2 μg/ml（r＝0.999 4）；精密度、稳定性、重复性的RSD＜1.0%；加样回收率为97.46%～99.72%（RSD＝0.75%，n＝6）。结论：该研究所建标准可用于青连宁心胶囊的质量控制。

青连宁心胶囊；青蒿素；高效液相色谱法；薄层色谱法；质量标准

快速性心律失常是临床上常见的心血管系统疾病，属于中医“心悸”范畴，具有起病急、病情复杂、治疗效果不佳等特点。青连宁心胶囊由黄连和青蒿两味药材组合而成，方中黄连味苦，性寒，有清热泻火、燥湿解毒之效；青蒿味苦、辛，性寒，有清热除蒸、化湿消痰之功。二药合用共奏清热化痰、宁心安神之功效，是治疗快速性心律失常的临床经验加减方。为有效控制该制剂的质量，笔者对其质量标准进行了研究——采用薄层色谱法（TLC）鉴别制剂中黄连和青蒿，高效液相色谱法（HPLC）测定其中青蒿素的含量。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括DAD二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；AV412型电子分析天平、CP2250型电子分析天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；LC-600B型数控超声波清洗机（山东济宁鲁超超声设备有限公司，功率：250 W，频率：40 kHz）；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

青连宁心胶囊（山东中医药大学附属医院药剂实验室自制，批号：20150518、20150524、20150530，规格：0.3 mg/粒）；青蒿素对照品（批号：100202-201004，纯度：98.8%）、盐酸小檗碱对照品（批号：MUST-15010411）、黄连对照药材（批号：120913-200407）均购于中国食品药品检定研究院；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 黄连 取本品内容物0.25 g，研细，加甲醇25 ml，超声处理30 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成盐酸小檗碱质量浓度为0.5 mg/ml的对照品溶液。再取黄连对照药材0.25 g，同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按青连宁心胶囊处方和工艺制备缺黄连的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按TLC法[2015年版《中国药典》（四部）][1]试验，吸取上述4种溶液各1 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1，V/V/V/V/V/V）为展开剂，置于浓氨液预饱和20 min的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，详见图1。

图1 黄连的薄层色谱图1.对照品；2.对照药材；3～5.供试品；6.阴性对照Fig 1 TLC chromatograms of Coptis chinensis1.reference substance；2.control medicinal herb；3-5.test samples；6.negative control

2.1.2 青蒿 取本品内容物3 g，加石油醚（60～90℃）50 ml，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加正己烷30 ml使溶解，加20%乙腈溶液振摇提取3次，每次10 ml，合并乙腈溶液，蒸干，残渣加95%乙醇0.5 ml使溶解，作为供试品溶液。另取青蒿素对照品适量，加95%乙醇制成青蒿素质量浓度为1 mg/ml的对照品溶液。按青连宁心胶囊处方和工艺制备缺青蒿的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按TLC法[2015年版《中国药典》（四部）][1]试验，吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙醚（4∶5，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以含2%香草醛的10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，置日光灯下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，详见图2。

图2 青蒿的薄层色谱图1.对照品；2～4.供试品；5.阴性对照Fig 1 TLC chromatograms ofArtemisia carvifolia1.reference substance；2-4.test samples；5.negative control

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液（45∶55，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：260 nm；柱温：30℃；进样量：10 μl。

2.2.2 对照品溶液的制备[2-3]精密称取青蒿素对照品5.62 mg，置于5 ml量瓶中，加95%乙醇溶解并定容，得青蒿素对照品贮备液；精密量取上述对照品贮备液1 ml，置于10 ml量瓶中，加0.2%氢氧化钠溶液4 ml，摇匀，置于50℃恒温水浴中反应30 min，取出，冷却至室温，加0.08 mol/L醋酸溶液定容，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品内容物适量，研细，取约1.53 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加95%乙醇50 ml，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再次称定质量，加95%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，得供试品溶液贮备液；精密量取上述供试品贮备液2 ml，置于10 ml量瓶中，加0.2%氢氧化钠溶液4 ml，摇匀，于50℃恒温水浴中反应30 min，取出，冷却至室温，加0.08 mol/L醋酸溶液定容，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按青连宁心胶囊处方和工艺制备缺青蒿的阴性样品，并按“2.2.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.2.5 系统适用性试验 分别取“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图3。在上述色谱条件下，理论板数以青蒿素峰计≥3 000；各成分基线分离良好，分离度＞1.5。

图3 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.青蒿素Fig 3 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.artemisinin

2.2.6 线性关系考察 分别精密量取“2.2.2”项下对照品溶液适量，分别置于10 ml量瓶中，加95%乙醇定容，制成质量浓度分别为5.62、11.24、22.48、33.72、56.2 μg/ml的系列对照品溶液。精密量取上述系列对照品溶液各10 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以青蒿素质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得青蒿素回归方程为y＝10.167x－14.845（r＝0.999 4）。结果表明，青蒿素检测质量浓度线性范围为5.62～56.2 μg/ml。

2.2.7 精密度试验 取“2.2.2”项下对照品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，青蒿素峰面积的RSD＝0.59%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取“2.2.3”项下供试品溶液（批号：20150518）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、10、12 h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，青蒿素峰面积的RSD＝0.44%（n＝6），表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.2.9 重复性试验 精密称取同一批样品（批号：20150518）适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，青蒿素峰面积的RSD＝0.61%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 取已知含量样品（批号：20150518）适量，共6份，分别加入一定质量的青蒿素对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.2.11 样品含量测定 取3批样品各适量，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 讨论

青蒿素是一种新型倍半萜内酯类化合物，20世纪70年代发现青蒿中含有抗疟成分青蒿素，目前青蒿素的测定方法尚未收录至《中国药典》，由于青蒿素没有共轭结构，化学性质不稳定，所以给测定带来了困难。已有文献报道了采用多种方法测定青蒿素含量，如薛洪宝等[4]用紫外和蒸发光散射检测器同时测定青蒿中6种成分，结果除了青蒿素外，其他5种成分紫外检测比蒸发光散射检测灵敏度高；周翱翱等[5]用HPLC-蒸发光散射检测法测定青蒿中青蒿素的含量；张东等[6]用HPLC-紫外吸收光谱（UV）-蒸发光散射检测法同时测定青蒿中的青蒿素、青蒿乙素和青蒿酸的含量；黄宇等[7]用碘量法测定黄花蒿中青蒿素的含量；周浓等[8]用紫外分光光度法测定重庆酉阳县7份不同产地黄花蒿；丁小莉等[9]通过比较UV和HPLC法测定青蒿中青蒿素的含量，结果发现HPLC法测定青蒿素较为准确，UV法不宜单独用于青蒿素的含量分析。

HPLC法能有效地将青蒿素和青蒿素类似物分离，排除干扰，精密度、稳定性均较好。青蒿素只有在205 nm波长处有末端吸收。本试验先用未衍生化的方法测定青蒿素，结果发现甲醇、乙醇等溶剂对青蒿素吸收峰有较大影响。文献研究发现，青蒿素检测方法还有柱前衍生和柱后衍生[10]，通过试验笔者最后确定采用柱前衍生化法测定青蒿素含量。查阅文献[11-13]发现，青蒿素能与碱发生反应，生成Q292，在292 nm波长处有最大吸收，但是Q292不稳定，且反应后生成的无机碱会对色谱柱造成损害，而Q292在pH5～6条件下易转化为化学性质相对稳定的Q260。故确定以衍生化HPLC法（检测波长：260 nm）测定青蒿素的含量。

综上所述，本研究所建标准可用于青连宁心胶囊的质量控制。

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Study on the Quality Standard of Qinglian Ningxin Capsule

SI Xixi1，SUN Hongsheng2，CAO Guangshang2，CHEN Qianqian1，LIU Dan1（1.College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；2.The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard of Qinglian ningxin capsule.METHODS：TLC was adopted for the qualitative identification of Coptis chinensis and Artemisia carvifolia.HPLC was used for the content determination of artemisinin：column was Diamonsil C18with mobile phase of methanol-phosphate buffer solution（45∶55，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 260 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The TLC spots of C. chinensis and A.carvifolia were clear and well separated，negative control without interference.The linear range of artemisinin was 5.62-56.2 μ g/ml（r＝0.999 4）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 1.0%；recovery was 97.46%-99.72%（RSD＝0.75%，n＝6）.CONCLUSIONS：The satandard can be used for the quality control of Qinglian ningxin capsule.

Qinglian ningxin capsule；Artemisinin；HPLC；TLC；Quality standard

R917；R927

A

1001-0408（2016）33-4707-03

2015-12-01

2016-03-07）

（编辑：张 静）

山东省重点研发计划项目（No.2014GGH219001）

＊硕士研究生。研究方向：中药制剂新剂型新技术。E-mail：810700090@qq.com

#通信作者：主任药师，硕士生导师。研究方向：中药制剂新剂型新技术。电话：0531-82929059。E-mail：shs7777@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.33