HPLC法同时测定桂朴微丸中厚朴酚、和厚朴酚的含量Δ

赵呈雷，黄一平，田耀洲，曹 鹏（南京中医药大学附属中西医结合医院/江苏省中医药研究院，南京 210028）

HPLC法同时测定桂朴微丸中厚朴酚、和厚朴酚的含量Δ

赵呈雷＊，黄一平，田耀洲，曹 鹏（南京中医药大学附属中西医结合医院/江苏省中医药研究院，南京 210028）

目的：建立同时测定桂朴微丸中厚朴酚、和厚朴酚含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Alltima C18，流动相为甲醇-水（70∶30，V/V），流速为1.0 ml/min，检测波长为294 nm，柱温为35℃，进样量为10µl。结果：厚朴酚、和厚朴酚检测进样量线性范围分别为0.206 4～2.064µg（r＝0.999 8）、0.088 0～0.880µg（r＝0.999 9）；定量限分别为0.41、0.26µg/ml，检测限分别为0.12、0.075µg/ml；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率分别为99.86%～102.11%（RSD＝1.02%，n＝6）、96.53%～101.74%（RSD＝1.83%，n＝6）。结论：该方法准确、灵敏、重复性好，可用于同时测定桂朴微丸中厚朴酚、和厚朴酚的含量。

桂朴微丸；厚朴酚；和厚朴酚；高效液相色谱法；含量测定

桂朴汤为临床上治疗胃气虚寒所致的胃脘痛以及消化不良、胃炎、胃或十二指肠溃疡等多种消化性疾病的常用方剂，该方出自清代孟河医派名医费伯雄所著《医醇胜义》中胃气虚寒作痛的效方[1]。原方为煎剂，患者使用不便，本课题组在桂朴汤的基础上通过对原方提取、纯化，加入相关辅料采用挤出滚圆法制备了桂朴微丸[2]。桂朴微丸由厚朴、肉桂、当归、茯苓、大枣等中药材组成，厚朴为方中君药，其味苦、辛，性温，归脾、胃、肺、大肠经，具有燥湿消痰、下气除满的功效[3]。药理学研究表明，厚朴具有广谱抗菌、抗炎、抗溃疡等作用[4-5]。厚朴酚、和厚朴酚为厚朴中木质素类成分中含量最高的化合物，也是厚朴的主要有效成分[6]。因此，本课题组采用高效液相色谱法（HPLC）建立了同时测定桂朴微丸中厚朴酚、和厚朴酚含量的方法，以期为更好地控制该制剂的质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Alliance 2695型HPLC仪，包括2695四元泵及自动进样系统、2996二极管阵列检测器、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；KQ-3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：150 W，频率：40 kHz）；AB204-S型万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 药品与试剂

桂朴微丸（江苏省中医药研究院制剂室自制，批号：111220、111222、111224，规格：2.128 g/1 000粒）；厚朴酚对照品（批号：110729-200411，纯度：98.4%）、和厚朴酚对照品（批号：110730-201011，纯度：98.4%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-水（70∶30，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：294 nm；柱温：35℃；进样量：10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取厚朴酚、和厚朴酚对照品各适量，置于同一10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得厚朴酚、和厚朴酚的质量浓度分别为1.032、0.440 g/L的混合对照品贮备液。精密量取上述混合对照品贮备液1 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制得厚朴酚、和厚朴酚的质量浓度分别为103.20、44.00µg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取样品适量，研细，取约2 g，精密称定，置于150 ml具塞锥形瓶中，加甲醇50 ml，称定质量，超声处理30 min，放冷，再次称定质量，以甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按样品的配方比例和工艺制备不含厚朴的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液，即得。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以厚朴酚峰计≥4 000。结果表明，其他成分对测定无干扰。

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0µl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（x，µg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得厚朴酚的回归方程为y＝2 000 000x－44 700（r＝0.999 8），和厚朴酚的回归方程为y＝2 000 000x－18 400（r＝0.999 9）。结果表明，厚朴酚、和厚朴酚检测进样量线性范围分别为0.206 4～2.064、0.088 0～0.880µg。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.和厚朴酚；2.厚朴酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1. honokiol；2.magnolol

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得厚朴酚、和厚朴酚的定量限分别为0.41、0.26 µg/ml；当信噪比为3：1时，得厚朴酚、和厚朴酚的检测限分别为0.12、0.075µg/ml。

2.6 精密度试验

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定6次，记录峰面积。结果，厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD分别为0.31%、0.51%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：111220）适量，分别于室温下放置0、1、2、4、6、8、10、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD分别为1.07%、0.37%（n＝8），表明供试品溶液在室温下12 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

精密称取同一批样品（批号：111220）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD分别为1.15%、1.91%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品（批号：111220）适量，精密称定，共6份，分别置于10 ml量瓶中，分别加入一定质量的厚朴酚、和厚朴酚对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.10 样品含量测定

取3批样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of content determination of sample（n＝3，mg/g）

3 讨论

3.1 提取溶剂和溶剂用量的选择

本课题组预试验考察了不同浓度的甲醇、乙醇及氯仿作为提取溶剂对桂朴微丸中厚朴酚、和厚朴酚提取总量的影响[7-8]。结果，甲醇的提取率最高且分离效果最好，因此本试验选择甲醇为提取溶剂。同时，还考察了甲醇用量（30、50、80 ml）对上述两种成分提取率的影响，结果显示甲醇为50 ml时，厚朴酚、和厚朴酚提取完全，因此本试验选择甲醇的用量为50 ml。

3.2 提取方法和提取时间的选择[9-11]

本课题组比较了超声提取法和热回流提取法对厚朴酚、和厚朴酚提取效率的影响。结果，超声提取和热回流提取对上述两种成分提取效率无显著差别，因超声提取法操作简单，因此本试验采用甲醇超声提取的方法制备供试品溶液。此外，本试验还考察了超声提取（15、30、45、60 min）对厚朴酚、和厚朴酚提取总量的影响，结果表明甲醇超声提取30 min后，延长提取时间，提取总量无明显差别，即超声提取30 min可将厚朴酚、和厚朴酚提取完全，因此本试验选择提取时间为30 min。

3.3 流动相的选择

本课题组考察了不同比例甲醇-磷酸[12]、甲醇-乙酸[13]、甲醇-水[14]以及乙腈-乙酸[15-16]等作为流动相时两种成分的分离情况。结果，以甲醇-水（70∶30，V/V）为流动相时厚朴酚、和厚朴酚的出峰时间合适、分离度良好、峰形好、无拖尾，且不受杂质干扰，故本试验选择甲醇-水（70∶30，V/V）为流动相。

综上所述，本方法准确、灵敏、重复性好，可用于同时测定桂朴微丸中厚朴酚、和厚朴酚的含量。

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Simultaneous Determination of Magnolol and Honokiol in Guipo Pellet by HPLC

ZHAO Chenglei，HUANG Yiping，TIAN Yaozhou，CAO Peng（Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210028，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of magnolol and honokiol in Guipo pellet. METHODS：HPLC was performed on the column of Alltima C18with mobile phase of methanol-water（70∶30，V/V）at a flow rate at 1.0 ml/min，detection wavelength was 294 nm，column temperature was 35℃and injection volume was 10µl.RESULTS：The linear range was 0.206 4-2.064µg for magnolol（r＝0.999 8）and 0.088 0-0.880µg for honokiol（r＝0.999 9）；limits of quantitation were 0.41，0.26 μg/ml，detection limits were 0.12，0.075 μg/ml，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 99.86%-102.11%（RSD＝1.02%，n＝6）and 96.53%-101.74%（RSD＝1.83%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is accurate，sensitive，reproducible，and suitable for the simultaneous determination of magnolol and honokiol in Guipo pellet.

Guipo pellet；Magnolol；Honokiol；HPLC；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）33-4695-03

2015-12-30

2016-09-10）

（编辑：刘 柳）

江苏省科技厅“科技基础实施建设计划”专项项目（No.BM2008152-KF03）

＊助理研究员，硕士。研究方向：中药新剂型与新技术。电话：025-52362182。E-mail：zhaocl292@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.29