有机磷农药乐果在厌氧消化系统中降解的实验研究

吉喜燕， 刘丽春， 张无敌， 尹 芳， 赵兴玲， 王昌梅， 柳 静， 杨 红， 刘士清

(1. 云南师范大学， 云南 昆明 650500； 2. 云南省丽江市农村能源管理站， 云南 丽江 674100)



有机磷农药乐果在厌氧消化系统中降解的实验研究

吉喜燕1， 刘丽春2， 张无敌1， 尹 芳1， 赵兴玲1， 王昌梅1， 柳 静1， 杨 红1， 刘士清1

(1. 云南师范大学， 云南 昆明 650500； 2. 云南省丽江市农村能源管理站， 云南 丽江 674100)

为了解决有机磷农药对环境造成的持久性污染，文章研究了利用厌氧消化法来降解有机磷农药。厌氧消化的原料采用废弃大白菜，有机磷农药采用乐果。利用乐果对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用得原理，采用分光光度法测定乐果在废弃白菜厌氧消化系统(湿发酵)中的浓度变化。实验结果表明乐果农药在厌氧消化系统中具有降解趋势，初始乐果滴入量越少厌氧消化罐中的乐果降解周期越短,在实验所设置的厌氧消化系统负荷之下，160 mg·L-1的乐果是此系统能够消解的极限。实验结果同时表明，乐果的浓度达到90 mg·L-1以上时，逐渐开始出现对厌氧消化系统产沼气的抑制作用，系统的产沼气能力降低，乐果浓度在150 mg·L-1以上时已对产气造成了严重抑制。

厌氧消化； 有机磷农药； 乐果； 降解

由于杀虫剂的广泛使用，不可避免地带了农药残留问题。在众多农药杀虫剂中，有机磷类农药凭借其强大的杀虫效果而被大量使用于农业生产中，有数据显示，在我国，有机磷农药的用量占到了农药总用量的一半[1]。现在世界上有机磷农药商品已达150多种，我国使用的有机磷农药约有30种，包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂[2]。有磷农药的过度使用必然造成农残超标，随着生物链的浓缩效应，极易造成人畜的急性中毒。

有机磷农药的降解是一个复杂的物理、化学和生物的协同过程[3-4]，有机磷农药的难降解性致使它对环境有极大的持久性危害性。由世界卫生组织统计，全世界每年的农药中毒人数大约有30万，其中有机磷农药中毒者占到了70%。根据我国农药学专家的筛选分级，发现每10种强烈污染环境的农药中就有7种属于有机磷农药类。因此，为了确保农业效益的提高和人民生活健康，必须要严格控制有机磷农药残留，寻找到有机磷农药的高效降解方法。

有机磷农药的危害已经引发国内外科学家的关注，并针对有机磷农药做了大量有价值的相关研究。目前国内外对于有机磷农药的降解方法有超声波技术、吸附、洗涤和电离辐射等物理方法；微生物、降解酶和工程菌等生物降解方法；水解、氧化分解和光化学降解等化学方法[5]。以目前的技术来看，农药残留降解的研究已进入分子水平，物理、化学和生物方法相互结合，同时也各有利弊。

此外，有效降解有机磷农药，降低蔬菜瓜果和土壤中有机磷农残也是至关重要的。然而面对有机磷农药降解成本高，有效菌株分离难以达到较高效率等诸多问题，有必要探索、研发一种操作简便、成本低廉，同时具有较高降解效率和良好效果的有机磷农药降解途径—厌氧消化系统降解有机磷农药。为了填补此类空缺，笔者针对有机磷农药之一乐果在厌氧消化(湿发酵)系统中的降解情况作了相关实验探究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验以云南省昆明市呈贡区柏枝营社区菜场的废弃白菜为厌氧消化底物，以实验室长期运行良好的中温厌氧消化反应器中的驯化猪粪污泥作为接种物，接种物TS含量为12.30%，VS含量为75.32%。废弃白菜的TS含量为13.3 %，VS含量为85.17%。实验使用的有机磷农药为市售40%的乐果乳油，在农药售卖店即可买到。

1.2 实验方法

1.2.1 建立厌氧消化系统

实验采用批量式发酵产沼气的装置，反应瓶规格为500 mL(共装入400 mL的物料)。接种物用量为整个反应体系质量分数的30%，即120g。整个厌氧消化反应体系干物质的浓度为6%，加入消化底物白菜 69.5 g。滴加乐果的量为0 mg，4 mg， 8 mg，12 mg，16 mg，20 mg，24 mg，28 mg，32 mg，36 mg，40 mg，44 mg，48 mg，52 mg，56 mg，60 mg，64 mg(每个浓度设置3个平行)设置实验条件为30℃恒温水浴。每个厌氧消化系统的农药具体滴加量和对应浓度见表1。

表1 乐果滴加量及初始浓度

实验启动后，每天记录每个发酵瓶的产沼气量、测定沼气中的甲烷含量并每天检测发酵料液中的乐果的含量(测定料液对乙酰胆碱酯酶的抑制率，再将抑制率带入工作曲线方程即可求得此抑制率对应的乐果农药的浓度)[6-9]。装置见图1。

A.水槽； B.液体取样管； C.玻璃导管； D.玻璃三通管； E.气体取样口； F.集气瓶； G.排水瓶； H.智能加热器； I.数字智能温控仪图1 厌氧消化反应装置

1.2.2 检测系统中的乐果含量

首先测定实验中装入厌氧消化反应系统中的白菜中乐果的残留含量，方法采用《GB/T5009-2002蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法标准》。按照国标要求提取白菜液，将按照国标要求配好的对照液和待测样品液放入721分光光度计的比色池中进行412 nm波长下吸光度的测试并记录3 min内的吸光度的变化ΔAt。按照公式，抑制率(%)=[(ΔA0-ΔAt)/ΔA0]，计算白菜中乐果对乙酰胆碱酯酶的抑制率。抑制率测定操作方法如下：

1.2.2.1 试剂

pH 值8.0缓冲液：分别取11.9 g无水磷酸氢二钾+3.2 g磷酸二氢钾+1000 mL蒸馏水

显色剂：分别取160 mg 二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)+15.6 mg碳酸氢钠+20 mL缓冲液，于4℃的冰箱中保存

底物：取25 mg的硫代乙酰胆碱+3 mL蒸馏水，摇匀后置于4℃冰箱中保存使用，但是保存期不得超过两周。

乙酰胆碱酯酶溶液：8 mg乙酰胆碱酯酶(AchE)+5 mL蒸馏水

1.2.2.2 样品提取

将收集来的废弃白菜洗去表面的泥土，用剪刀剪成1 cm左右的方碎片，取剪好的白菜1 g,放入锥形瓶中，加入5 mL缓冲液，震荡1～3 min，倒出白菜提取液，在摇床上震动5 min，用滤纸滤除提取液，静置5 min待用。

1.2.2.3 对照溶液

于试管中加入2.5 mL缓冲液，再加入0.1 mL酶液，0.1 mL显色剂，摇匀后置于37℃水浴中保持15 min。加入0.1 mL底物摇匀，此时被测液体开始显色反应，应将其立即放入分光光度计比色池中，记录反应 3 min的吸光值的变化ΔA0。

1.2.2.4 样品测试

于试管中加入2.5 mL的提取液，其他操作与对照溶液测试的操作相同，记录反应3 min的吸光值的变化ΔAt。结果按照公式(1)计算:

(1)

式中：ΔA0为对照溶液反应3 min的吸光值变化值；ΔAt为样品溶液反应3 min的吸光值变化值。

1.2.2.5 判定依据

根据酶抑制率曲线方程来确定乐果的精确含量。

1.2.3 乐果工作曲线绘制

乐果(Dimethoate)具有较高毒性，能够造成乙酰胆碱酯酶的不可逆抑制，从而降低了酶的催化活性，减缓底物水解速度，进而影响显色反应，引起产物在412 nm波长下吸光度值的变化[10-12]。按实验中酶抑制分光光度法研究了不同浓度乐果对固定化酶(乙酰胆碱酯酶)的抑制作用，如图2工作曲线。首先把乐果配成10 mg·L-1，20 mg·L-1，30 mg·L-1，40 mg·L-1，50 mg·L-1，60 mg·L-1，70 mg·L-1，80 mg·L-1，90 mg·L-1，100 mg·L-1，110 mg·L-1，120 mg·L-1，130 mg·L-1，140 mg·L-1，150 mg·L-1，160 mg·L-1一系列浓度的标准溶液，然后测定反应体系的吸光度，按照下列公式计算抑制率：

y=(A空白-A抑制)/A空白×100%

以y=30%为检测限。以抑制率y为纵坐标对乐果浓度(mg·L-1)作图得固定化酶抑制乐果的工作曲线，在30～130 mg·L-1范围内呈现性关系，线性回归方程为y=0.5026x+14.53，相关系数R2=0.9972，最低检出限为30 mg·L-1。乐果的工作曲线见图2[13-14]。

由图2可以看出，当农药样品的浓度在30～130 mg·L-1时，农药乐果对乙酰胆碱酯酶的抑制率与农药浓度成线性关系，即抑制率对农药浓度的线性回归范围在30～130 mg·L-1之内。如果浓度过高时，可以将其稀释到线性回归的浓度范围之内来计算。

图2 乐果的酶抑制工作曲线

2 实验结果与分析

2.1 乐果在厌氧消化系统中的浓度变化量

经过32 d的厌氧消化周期，在产沼气周期完结的同时，被滴进厌氧消化系统的乐果也得到了有效的降解。乐果在每组厌氧消化系统中浓度的变化见图3。从图中可以看出初始滴入量较少的厌氧消化罐中的乐果降解周期越短，30 mg·L-1初始浓度组的降解至无法检出，只需3 d，其后，随着初始滴入农药浓度的加大，其降解周期逐渐增长：从5 d，8 d，12 d，13 d，15 d，18 d，20 d，25 d，28 d，32 d不等。另外，从图中可以显然地看出，农药的初始浓度越大，它的降解周期越长并且越难彻底降解，其降解曲线在相同时刻下的斜率也远远小于低浓度的实验组。在实验周期的前5 d这个时间段内，30 mg·L-1,40 mg·L-1两个浓度的乐果农药被厌氧消化系统降解完全。厌氧消化启动15 d之内，130 mg·L-1以下浓度的乐果农药被消解完全，经过回归计算，他们消解后的浓度均接近于0 mg·L-1。当农药初始浓度超过140 mg·L-1时，其降解周期明显增加，尤其当农药的初始浓度增加至160 mg·L-1时，其降解的速率明显下降，直至厌氧消化的周期结束，依然有少量的乐果未被彻底降解。

从图3可以推断，乐果可以在以废弃白菜为发酵底物的厌氧消化系统中得以有效降解，农药浓度越大，所需的消解完全的周期越长。在本实验设计的厌氧消化体系负荷之下，其所能承受的可以消解的乐果的上限为160 mg·L-1。

图3 乐果浓度在厌氧消化系统中随时间的变化

2.2 日产气量和累积产气量分析

自厌氧消化实验启动之日起，对照组、各个实验组均正常产气，均无酸化现象。每天记录每个厌氧消化系统的产沼气量。具体的日产沼气量情况见图4。从图4，可以直观地看出实验中，90 mg·L-1浓度以下的厌氧消化反应体系中，日产沼气量和未滴加乐果的反应体系中的日产沼气量几乎相差无几。此浓度以下的反应体系日产气量高峰都集中在反应周期的第7～11 d。并且在此浓度段，乐果的浓度并没有对日产气量、日产气量高峰值产生负影响。从100 mg·L-1乐果浓度至140 mg·L-1浓度段，则对日产气量的高峰产生了负面影响，从图4中不难看出，此浓度段的乐果致使反应体系在日产气量高峰下降的同时，将日产气量的高峰向后推迟到反应周期的第18～20 d。图中表征更为明显的是当乐果浓度升至150～160 mg·L-1浓度段时，乐果的存在已经严重抑制了系统的正常产气，此浓度段的日产气量高峰只有130 mL，仅为其他反应系统日产气量最高峰的15%左右。同时日产气量的高峰期被推至整个厌氧消化周期的末期，大约在反应周期的第23至24 d。

图4 不同浓度乐果对厌氧消化日产沼气量的影响

显而易见，图4展现了整个厌氧消化周期中乐果对底物消化日产沼气量的影响。可以由图中表征的现象推断，在乐果的浓度达到90 mg·L-1以上时，逐渐开始发挥出对厌氧消化系统产沼气的抑制副作用。此浓度以上的阶段逐渐使系统的产沼气能力降低。尤其150 mg·L-1以上的乐果浓度已经对产气造成了严重影响和抑制。推断造成此种负面现象的原因，有可能是较高浓度的乐果致使产甲烷细菌活性的丧失，或者是乐果存在的环境杀死了大量的产甲烷细菌和产氢产乙酸菌，从而导致产沼气能力的直接降低。

图5 不同乐果浓度在厌氧消化体系累积产气量

对应图4，不同浓度乐果对各组厌氧消化系统日产沼气量的影响也同样直接反应在累积产气量的变化情况上面。图5详细表征了实验中各组厌氧消化系统的累积产气量情况。从图中可以看出累积产气量增长最为快速，也就是曲线斜率最大的阶段恰好对应图4中日产气量的高峰阶段。显而易见，各个厌氧消化系统的累积产量的最终值呈3个区域分布：第1个区域是2600 mL至3200 mL，存在于此区域30 mg·L-1至60 mg·L-1初始浓度段；第2个区域是70 mg·L-1至140 mg·L-1浓度段；第3个区是2300 mL以下，位于此区域的是150 mg·L-1和160 mg·L-1两个浓度。这表明，较高浓度的乐果已经抑制了厌氧消化系统的正常产气。

2.3 甲烷含量变化和pH值变化分析

在厌氧消化中滴加入乐果农药之后，随着实验启动之后每天测定各个厌氧消化系统所产沼气的甲烷含量。每个初始农药浓度下的产气甲烷含量如图6。

从图6中可以看出，滴加农药组和未滴加农药的厌氧消化系统在10 mg·L-1至130 mg·L-1浓度段时所产沼气的甲烷含量没有明显差别。也就是说，在此浓度段内，乐果的加入并没有对沼气甲烷含量产生影响。但是，当滴加农药的初始浓度在140 mg·L-1至160 mg·L-1时，甲烷含量明显下降，甲烷含量高峰也仅为50%，而甲烷含量最高的30 mg·L-1组的甲烷含量高峰则在70%。这说明在实验所设置的厌氧消化系统负荷之下，当乐果的浓度达到140～160 mg·L-1时，就会对厌氧消化产沼气的质量产生持续性的负面影响。

图6 不同乐果浓度下产沼气甲烷含量

图7 不同乐果浓度下厌氧消化料发酵料液pH值变化

实验过程中，在检测了厌氧消化系统的甲烷含量变化这一参数之外，同时还测定了发酵料液的pH值变化。并将厌氧消化实验周期内发酵料液每天的pH值随时间的变化情况绘制成图7。实验中的pH值由美国Thermo Euthech台式pH测试仪测定，测量精度为±0.1。从图7可以看出，在实验启动的第1 d，滴加农药初始浓度越高的发酵料液其pH值就越小。农药初始浓度越低的系统，发酵料液的pH值就相对于农药浓度高的系统要高，但是所有滴加乐果农药的发酵料液的初始pH值均在6以下，说明滴加乐果农药后，导致了原发酵料液酸性增强，并且乐果农药的浓度越大，致酸性就越强。究其原因，是因为乐果农药一般呈现弱酸性，随着厌氧消化过程的进行，所有滴加农药的系统中的料液的pH值随着乐果在系统中的浓度越来越低而逐渐呈升高趋势，这也从另一方面验证了乐果农药的结构和性质在厌氧消化的作用下发生改变，一定程度上失去了酸性。随着乐果的降解，各个滴加有乐果农药的厌氧消化系统的pH值又渐渐恢复到了甲烷细菌最适宜的生长环境，即6. 5～7.3之间。

3 结论与展望

实验探究了乐果在厌氧消化系统中的降解情况，通过对所得实验数据的处理和分析，得到以下4个结论：

(1)乐果能够在以废弃白菜为消解底物的中温(30℃)厌氧消化系统中得到有效降解。实验中设计的农药浓度梯度范围之内可以100%降解完全。所有系统降解速率最快、效率最高的乐果降解高峰期集中在整个厌氧消化周期的前5 d。

(2)当乐果农药浓度达到90 mg·L-1以上时，开始对正常的厌氧消化系统的产气情况产生负面影响：导致日产气量高峰的降低和高峰来临时间不同程度的滞后；导致累积产气量的逐步减少和日产气量增长速率的明显降低。

(3)当农药的浓度范围在10 ～130 mg·L-1时，每个系统所产沼气中的甲烷颔量均与无乐果农药滴加的系统相差无几，但当乐果浓度提升至140～160 mg·L-1时，其甲烷含量明显降低，即高浓度乐果对甲烷含量的提升产生了负影响。

(4)乐果的滴加会使系统变酸，随着乐果的消解，发酵料液的pH值又恢复到有利于厌氧消化进行的正常pH值环境。随着乐果农药的消解，整个系统的pH值缓慢平稳上升，但上升的限值是7.2。

通过以上4个结论，不难推测，乐果这种有机磷农药有望依靠以厌氧消化为主要工艺的沼气工程来加以消解，以此可以解决废弃蔬菜和土壤中有机磷对环境的污染和破坏，在有效降解有机磷的同时，还产生了绿色能源—沼气。在下一步工作中，笔者研究组将对乐果在厌氧消化系统中的降解最大负荷做进一步测算，并进行沼气工程的相关设计和计算，从而实现废弃蔬菜有机磷农药降解在工程方面的推广。

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Experiment on Degradation of Organophosphorus Pesticide of Dimethoate in Anaerobic Degradation System /

JI Xi-yan1, LIU Li-chun2, ZHANG Wu-di1, YIN Fang1, ZHAO Xing-ling1, WANG Chang-mei1, LIU Jing1, YANG Hong1, LIU Shi-qing1/

Yunnan Normal University, Kunming 650500, China; 2. Yunnan Lijiang City Rural Energy Station, Lijiang 674100, China)

The anaerobic digestion was adopted to degrade organophosphorus pesticides of dimethoate in this paper. Waste cabbage was used as raw material for anaerobic digestion. Dimethoate was dropped into the digester. The dimethoate content during the digestion was detected by spectrophotometry. The result showed that dimethoate could be degraded in anaerobic digestion, in which the lower the dimethoate concentration, the quicker the degradation speed, and dimethoate concentration of 160 mg · L-1was the highest degradable concentration in this designed experiment. At the dimethoate concentration of 90 mg · L-1, there began to appear the biogas production inhibition, and when the dimethoate concentration was over 140 mg · L-1, the inhibition became serious.

anaerobic digestion; dimethoate; degradation; enzyme inhibition method

2016-01-11

项目来源： 高等学校博士学科点专项科研基金(20135303110001)； 国家自然科学基金(51366015)； 云南省应用基础研究基金重点项目(2014FA030)； 云南省科技创新提升计划(2013DH041); 云南省农村能源工程重点实验室基金(2015)

吉喜燕(1989- )，女，河南洛阳人，硕士，研究方向为生物质能与环境工程，E-mail:ji_xiyan@126.com

张无敌，E-mail:wootichang@163.com; 尹 芳，E-mail:yf709@sina.com

S216.4; X171

A

1000-1166(2016)04-0013-06