与尖吻蝮蛇出血毒素高亲和力动物血管壁蛋白的提取与检测

韦传宝，邓 辉

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.抗体制备及其质量检测中心，安徽 六安 237012)



与尖吻蝮蛇出血毒素高亲和力动物血管壁蛋白的提取与检测

韦传宝1，2，邓 辉1

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.抗体制备及其质量检测中心，安徽 六安 237012)

为了测定动物血管壁上是否含有对尖吻蝮蛇出血毒素有高亲和力的靶蛋白，从4种蛋白质提取试剂盒种筛选1种试剂盒，提取11种动物的血管壁蛋白质，用血管壁蛋白质作为抗原，采用ELISA检测方法测定提取的血管壁蛋白质是否含有与尖吻蝮蛇出血毒素有高亲和力的靶蛋白。结果表明：三种酸性出血毒素(AaH Ⅰ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ)对11种动物血管壁提取蛋白的检测结果为阳性，碱性出血毒素(AaH Ⅲ)对11种动物血管壁提取蛋白的检测结果基本上为阴性。因此，动物体内，特别是作为尖吻蝮蛇食物来源的动物体内血管壁上可能含有与尖吻蝮蛇出血毒素有高亲和力的靶蛋白。

尖吻蝮蛇；出血毒素；靶蛋白；ELISA检测

尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus) 俗称五步蛇, 属蝰科、蝮亚科、蝮属，分布于我国长江以南地区(包括台湾)，是我国特有蛇种，剧毒。该蛇为血循环型毒蛇, 咬伤后伤口和内脏大量出血，致死、致残率极高。

前人从不同产地的尖吻蝮蛇毒中分离出多种出血毒素。徐询等[1]最先从皖南产尖吻蝮蛇毒中分离出3种低分子量出血毒素，分别命名为出血毒素Ⅰ(AaH Ⅰ)、出血毒素 Ⅱ(AaH Ⅱ)和出血毒素 Ⅲ(AaH Ⅲ)；随后朱中良等[2]从皖南产尖吻蝮蛇毒中纯化出1种中等分子量的出血毒素，命名为出血毒素Ⅳ(AaH Ⅳ)。

对尖吻蝮蛇出血毒素分离和性质方面的研究较为深入，但对出血机制的研究很少，一直未有实质性的突破。何华平等[3]用辣根过氧化物酶标记AaH Ⅰ并进行免疫组织化学实验，观察到AaH Ⅰ可以特异地结合到家兔毛细血管壁上，推测毛细血管内壁上可能存在AaH Ⅰ的靶蛋白。论文作者韦传宝等[4]研究125I-AaH Ⅰ和肾毛细血管组织的结合特性，发现125I-AaH I和家兔肾毛细血管组织的结合具有时间饱和性、浓度饱和性，未标记AaH I与125I-AaH I有竞争结合特性，pH低于5.8或高于8.0时结合能力下降，这些特性间接证明血管壁可能有AaH I靶蛋白存在。本研究用蛋白质提取试剂盒提取血管壁蛋白质，用ELISA检测方法测定血管壁上是否含有与尖吻蝮蛇出血毒素有亲和力的蛋白质-靶蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料

尖吻蝮蛇毒购自安徽省祁门县祁门蛇伤研究所；羊抗小鼠IgG-碱性磷酸酶购自Sigma公司；四种出血毒素(AaH Ⅰ、AaH Ⅱ、AaH Ⅲ和AaH Ⅳ)、四种出血毒素的抗血清由皖西学院蛋白质与酶工程研究中心提供；蛋白抽提试剂盒(通用型，W001)、膜蛋白抽提试剂盒(增强型，W002)、蛋白抽提试剂盒(CW004)、蛋白抽提试剂盒(CW0891)购自Vazyme公司；其他试剂均为国产分析纯；蛋白质纯化系统、层析柜、酶标仪、电泳仪、电泳槽等。

1.2 血管丰富组织的获得

取小鼠肌肉组织各10 g，加入20 mL生理盐水，置组织捣碎机粉碎。取出破碎后的悬浮，在1 000 r/min的转速下离心5分钟，弃去上清液(破碎的肌肉组织)，沉淀为血管组织丰富的部分，沉淀用生理盐水洗涤、离心，重复3次，进一步去除破碎组织，将沉淀分装放入-80 ℃超低温冰箱中保存，待用。

1.3 蛋白质提取试剂盒的筛选

以1.2制备的血管丰富组织为材料，分别用购买的4种蛋白质提取试剂盒提取血管壁蛋白质，4种试剂盒分别为：蛋白抽提试剂盒(通用型，W001)、膜蛋白抽提试剂盒(增强型，W002)、蛋白抽提试剂盒(CW004)、蛋白抽提试剂盒(CW0891)，血管丰富组织用量为0.1 g,提取的操作按照说明书步骤进行。获得的4种蛋白质提取物进行ELISA检测，确定哪种试剂盒提取的蛋白质含靶蛋白。采用ELISA方法检测，形成的复合物为：高亲和性蛋白(靶蛋白)-对应的出血毒素-对应出血毒素IgG-二抗(碱性磷酸酶共价结合)。

1.4 不同动物血管壁蛋白的提取

准备11种动物的肌肉组织，11种动物分别为：河虾、田螺、泥鳅、鲫鱼、黄鳝、牛蛙、甲鱼、乌龟、鸽子、猪和小白鼠。首先制备11种动物的血管丰富组织，然后用“1.3 蛋白质提取试剂盒的筛选”筛选的蛋白质提取试剂盒提取11种动物肌肉血管壁蛋白，血管丰富组织用量为0.1 g,提取的操作按照对应试剂盒的说明书操作步骤进行。提取的蛋白质冷冻条件下保存待用。

1.5 与尖吻蝮蛇出血毒素高亲和力靶蛋白的检测

采用常规的ELISA检测[5](P158-183)，大致过程如下：1)用包被液(0.05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6)稀释提取的血管壁蛋白。取0.2 mL 蛋白质提取液，加0.8 mL 包被液，稀释后溶液的pH约9.6。以稀释后血管壁蛋白作为包被抗原，以包被液代替样品作为空白对照。2)加纯化的尖吻蝮蛇出血毒素，如果提取的血管壁蛋白中含与出血毒素亲和力强的蛋白质-靶蛋白，将形成：高亲和性蛋白(靶蛋白)-出血毒素复合物。3)加对应出血毒素的抗血清，将形成复合物：高亲和性蛋白(靶蛋白)-出血毒素—对应出血毒素IgG。4)加碱性磷酸酶共价结合的羊抗小鼠IgG(二抗)，将形成复合物：靶蛋白-出血毒素-对应出血毒素IgG-二抗。5)加碱性磷酸酶底物p-NPP，显色30分钟后，在酶标仪上测定OD405 nm吸光值。样品孔的OD405 nm值如果大于空白对照OD405 nm值2.1倍确定为检测阳性，否则确定为检测阴性。

2 结果与分析

2.1 合适试剂盒的筛选

四种蛋白质提取试剂盒提取的蛋白ELISA检测结果为：蛋白抽提试剂盒(通用型，W001)OD405 nm=0.230；膜蛋白抽提试剂盒(增强型，W002)OD405 nm=1.570；蛋白抽提试剂盒(CW004)OD405 nm=0.433；蛋白抽提试剂盒(CW0891)OD405 nm=0.688；膜蛋白抽提试剂盒(增强型，W002)提取的效果最好，我们选择该试剂盒作为提取11种动物组织血管壁蛋白的试剂盒。

2.2 11种动物组织血管壁蛋白的提取

经过膜蛋白抽提试剂盒(增强型，W002)的提取获得了11种动物组织的血管壁蛋白提取液，每种动物的提取液约0.6 mL。

2.3 ELISA检测结果

11种动物血管壁蛋白提取液的ELISA检测结果见表1。

表1 11种动物血管壁蛋白提取液的ELISA检测结果

从表1中可以看出，三种酸性出血毒素(AaH Ⅰ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ)对11种动物血管壁提取蛋白的检测结果均为阳性，碱性出血毒素(AaH Ⅲ)对11种动物血管壁提取蛋白的检测结果基本上为阴性。说明动物体内，特别是作为尖吻蝮蛇食物来源的动物体内血管壁上可能含有与出血毒素有高亲和力的靶蛋白。

3 讨论

对毒蛇神经毒素的受体及其作用机制研究比较清楚，蛇毒神经毒素结合到哺乳动物神经突轴(或神经-肌肉结合部)的特异受体上，抑制神经冲动的传导。目前，对出血机制的研究报道大多与人体病理有关[6-8]，对动物出血毒素出血机制的详细研究未见报道。蛇毒出血毒素通过直接破坏血管壁基底膜而出血，但出血机制尚处于推测和假说阶段，关键问题是不知道血管壁上是否有出血毒素的靶蛋白，更不知道靶蛋白的性质，本研究目的是确认动物血管壁上是否存在尖吻蝮蛇出血毒素的靶蛋白，由于碱性出血毒素很少见，出血活性也比较低，本研究出现的碱性出血毒素(AaH Ⅲ)对11种动物血管壁提取蛋白的检测结果基本上为阴性的结果，不能够代表出血毒素的一般性质，因此，本研究结果与前人的实验结果相似[3，4]，倾向于推测动物血管壁上有与尖吻蝮蛇出血毒素高亲和力的蛋白，或者称为靶蛋白。这种推测是否真实需要进行靶蛋白的分离，只有分离出靶蛋白才能够将推测变为现实，分离靶蛋白也是我们今后工作的一个努力方向，只有解决了这个问题，与出血机制相关的其他问题才能获得解决。

目前治疗蛇伤的有效方法是注射抗尖吻蝮蛇毒血清，但抗蛇毒血清中抗出血毒素IgG浓度较低，加上IgG与出血毒素的结合是可逆的，出血毒素与靶蛋白的结合可能更紧密，因此治疗效果不佳。靶蛋白确定后可以通过研制类似靶蛋白的物质代替抗血清治疗蛇咬伤，为有效治疗尖吻蝮蛇咬伤开辟了新途径。

[1]Xu X， Wang C， Liu J， et al. Purification and Characterization of Hemorrhagic Components fromAgkistrodonacutus(Hundred Pace Snake) Venom[J]. Toxicon, 1981,19(5):633-644.

[2]Zhu Z L, Gong W M, Zhu X Y, et al. Purification, Characterization and Conformational Analysis of a Haemorrhagin from the Venom of Agkistrodon Acutus[J].Toxicon,1997,35(2):283-292.

[3]何华平，王玉珍，徐询.酶标法观察尖吻蝮出血毒素Ⅰ对毛细血管的作用[J].动物学研究，1988(9)：99-101.

[4]韦传宝，胡健饶，许宁一.尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)毒出血毒素I出血机制的研究[J].科技通报，2003，19(2)：154-158.

[5]徐宜为.免疫检测技术[M].3版.北京：科学出版社，1991.

[6]Guohua Xi, Richard F. Keep. Intracerebral Hemorrhage: Mechanisms and Therapies[J]. Translational Stroke Research, 2012, 3(1):1-3.

[7]P. Bouz, A. Zouros, A. Taha, et al. Neonatal Intracerebral Hemorrhage: Mechanisms, Managements, and the Outcomes[J].Translational Stroke Research, 2012, 3(1):6-9.

[8]Josephine Lok, Wendy Leung, Sarah Murphy, et al. Intracranial Hemorrhage: Mechanisms of Secondary Brain Injury [J]. Acta Neurochirurgica Supplementum, 2011(111): 63-69.

Extraction and Test of High Affinity Target Protein to Agkistrodon acutus Hemorrhagin on Animal Vascular Wall

WEI Chuanbao1,2, DENG Hui1

(1.CollegeofBiologicalandPharmaceuticalEngineering,WestAnhuiUniversity,Lu’an37012,China; 2.AntibodyPreparationandPropertyTestResearchCenter,WestAnhuiUniversity,Lu’an37012,China)

Objective: Determine whether there is high affinity target protein toAgkistrodonacutusHemorrhagin on animal vascular wall. Methods: A protein extraction reagent kit was chosen from four kinds of protein extraction reagent kit. The protein of eleven kinds of animal vascular wall was extracted using the kit which had been chosen. The vascular wall protein was used as antigen and the high affinity target protein toAgkistrodonacutushemorrhagin was tested through ELISA test. Results: There is target protein toAgkistrodonacutusHemorrhagin AaH Ⅰ, AaH Ⅱand AaH Ⅳ in all eleven kinds of animal vascular wall protein. There is no target protein toAgkistrodonacutusHemorrhagin AaH Ⅲ in all eleven kinds of animal vascular wall protein. Conclusion: In animal especially for the animal as a food source forAgkistrodonacutus, there is target protein ofAgkistrodonacutushemorrhagin on vascular wall.

Agkistrodonacutus; Hemorrhagin; target protein; ELISA test

2016-08-26

安徽自然科学基金项目(1408085MC43)；安徽省教育厅自然科学重点项目(KJ2015A454，KJ2013A264)。

韦传宝(1961-)，男，安徽六安人，教授，博士，硕士生导师，研究方向：蛇毒蛋白。

R991

A

1009-9735(2016)05-0001-03