羽绒中DNA提取方法及鸭绒鹅绒成分的定量检测

吴姗++++虞惠贞++++任明兴++++方莹

摘要：为提高用PCR法鉴定鸭绒鹅绒的准确度，提高羽绒中DNA的提取效率，优化了DNA提取方法；同时为了便于对羽绒制品的真伪鉴别，建立了羽绒中鹅绒鸭绒等的定量计算方法。通过比较5种前处理方法和4种抽提试剂盒及其组合间的抽提效率，建立最佳的抽提程序。利用荧光PCR定量的优势，建立了羽绒中的鹅绒鸭绒比例定量计算的方法，并将计算得到的值与预设的混合比例加以比较。经验证，本研究建立的鹅绒鸭绒等定量计算方法能准确反映含量变化的趋势，可作为一种有效的辅助手段对羽绒制品进行真伪甄别。

关键词：羽绒；DAN提取；荧光PCR；定量检测；真伪甄别

我国是世界上最大的羽绒及制品的生产国和出口国，也是最大的消费国[1]。目前市场上羽绒产品主要是鹅绒、鸭绒两大类，两种绒在外观上并无明显区别，但在保暖性能上，相同含量的鹅绒要优于鸭绒，鹅绒的价格要高于鸭绒[2]。因此出现了将鸭绒或其他陆禽的毛绒掺在鹅毛绒中进行销售，以牟取暴利的现象。鸭、鹅毛绒的鉴别是羽毛绒检测中重要一项，相关标准，如GB/T 10288—2003《羽绒羽毛检验方法》，FZ/T 80001—2002《水洗羽毛羽绒试验》等为鹅、鸭毛绒的种类鉴定提供依据。但在日常检测中，一方面，相关标准基本上都是一些文字性说明，检验人员难以准确掌握；另一方面，鸭、鹅毛绒以各种形式存在，羽毛分为正常和损伤两种，羽绒主要指绒子和绒丝，绒子还分为朵绒、未成熟绒、类似绒和损伤绒等，微观显微结构存在交叉、雷同现象，给检验造成了困难[3]。

陈国培等[4]设计了鸭和鹅物种特异性的引物探针，并通过建立荧光PCR的方法对鸭绒和鹅绒进行鉴定，该方法克服了显微镜观察法主观性大的缺点，可作为显微镜法有效的辅助检测手段。以DNA为目标检测物的PCR方法，其前期DNA的提取质量直接关系到整个检测过程的成败。该文献报道使用SDS-异硫氰酸胍-β-巯基乙醇的提取方法能满足检测的需求，但该方法比较耗时费力，整个提取步骤仅水浴就耗时6个小时，而DNA还需要沉淀过夜进行收集。除此以外，关于从羽绒制品中提取DNA的方法则鲜有报道。为提高用PCR法鉴定鸭绒鹅绒的准确度，我们尝试了不同前处理方法和不同抽提试剂盒，以提高鸭绒、鹅绒提取DNA的效率。在此基础上，我们利用荧光PCR可定量的特性，建立了羽绒制品中鹅绒、鸭绒等比例的计算方法。

1 材料和方法

1.1 羽绒

羽绒样品来自浙江中大技术进出口集团有限公司和浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心微生物实验室。在各种前处理和DNA提取方法的比较试验中，选用了“北京白鸭绒”“波兰白鸭绒”和“东北白鹅绒”3个样品；在后续的羽绒样品DNA提取和物种成分检测试验中所用的样品见表1。

1.2 DNA抽提

（1）DNA抽提前的处理

在用试剂盒抽提DNA前，先用剪刀将羽绒尽可能地剪碎剪小，然后再进行以下前处理：前处理A——不再做任何前处理，直接按照试剂盒步骤进行DNA抽提；前处理B——振荡研磨法：将剪碎的羽绒放入带有磁珠（Φ3mm，Sigma，美国）的管子中，用振荡研磨仪进行研磨（5500 r/min 振荡20s，重复4～6次）；前处理C——手工液氮研磨法：将剪碎的羽绒放入研钵，加入液氮，手工研磨至细末；前处理D——振荡研磨法+手工液氮研磨法：即经过振荡研磨处理后的样品，再用液氮研磨处理；前处理E——机器液氮研磨法：使用冷冻研磨仪进行研磨，研磨程序设置为：研磨循环数为1，预冷时间7min，研磨时间2min，研磨间隔时间2min，运行频率12次/min。

经过上述前处理的样本各取50 mg，用DNA抽提试剂盒K1按照说明书进行抽提，最后将抽提得到的DNA溶解在50μL水中。重复3次。

将上述抽提得到的DNA，进行浓度、纯度检测，同时进行荧光PCR检测。

（2）DNA抽提试剂盒

通过DNA浓度、纯度比较和荧光PCR检测结果比较，在A、B、C、D、E中选择一种较理想的方法，作为统一的前处理的方法，在此前基础上，再比较不同DNA抽提试剂盒的提取效果。各种试剂盒如下：K1试剂盒：Promega（美国）FF3750抽提试剂盒，该方法是磁珠吸附法，整个过程耗时1.5h～2h，取样量为50 mg，最后抽提得到DNA溶解在50 μL水中。K2试剂盒：Promega（美国）DC6740抽提试剂盒，该方法是磁珠吸附法，整个过程耗时不超过2h，取样量为50 mg，最后抽提得到DNA溶解在50 μL水中。K3试剂盒：QIAamp（美国）56304抽提试剂盒，一管取样10 mg（试剂盒要求一次取样量不超过10 mg），共抽提5管（5个样），最后5个管抽提得到DNA都用同一50 μL水重复洗脱，作为一个样品。K4试剂盒：QIAamp（美国）51304抽提试剂盒，取样25 mg（试剂盒要求一次取样量不超过25 mg），共抽提两管（两个样），最后两个管抽提得到的DNA都用同一50 μL水重复洗脱，作为一个样品。

上述K3和K4方法是膜柱法，根据说明书，样品中加入裂解液后，一般水浴分别为1h～3h和4h～6h，但为了裂解充分建议裂解过夜，我们在K3和K4的抽提过程中都采用了过夜的方法，但裂解后的抽提程序相对简单，整个过程不超过1.5h。上述不同试剂盒抽提各重复3次。

1.3 荧光PCR反应

对上述抽提得到的DNA进行鸭、鹅和鸡等物种检测，检测方法参照标准SNT 2727—2010《饲料中禽源性成分检测方法 实时荧光PCR方法》。荧光PCR扩增体系配制及扩增温度和时间见标准。

1.4 标准曲线绘制

为检测荧光PCR检测体系的检出限和线性范围，对鸭和鹅肉中抽提得到的DNA进行梯度稀释，并利用DNA浓度和Ct（Ct表示每个反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）值之间的相关性绘制标准曲线。鸭肉和鹅肉的DNA抽提方法采用前处理B和K1提取试剂盒的组合，抽提得到的两种DNA，都统一调节浓度至20 ng/μL，后进行4倍梯度稀释。变量相关性公式[5]：Ct = b·log[DNA浓度] + a，其中：b是斜率；a是截距。

1.5 混合样的制备，以及计算鸭成分和鹅成分的计算

取波兰白鸭绒和东北白鹅绒为材料，将鸭绒和鹅绒按不同的质量比进行混合，后采用前处理B和K4提取试剂盒的组合进行DNA抽提。荧光PCR后通过标准曲线计算得到每个样品中鸭和鹅的DNA浓度，计算两者间比例，并与设置的鸭绒与鹅绒的比例进行比较。

2 结果

2.1 不同前处理对DNA质量的影响

处理A，即羽毛绒仅做剪碎处理，该处理的DNA浓度都非常低，仅2 ng/μL左右，而OD260/OD280的值在2.4～3.0之间（见表1），说明所抽提的DNA纯度较低。经过B的磁珠研磨和C的液氮研磨处理，抽提得到的DNA浓度有所上升，平均值达到4 ng/μL左右，而OD260/OD280的值虽未达到理想的1.8，但平均值介于1.5～2.3之间，纯度优于A处理。D是B和C处理的组合，即经过磁珠研磨和液氮研磨两重处理；而E是通过液氮研磨仪处理的，其过程也是将样品浸入在液氮环境中进行物理机械研磨，即集液氮处理和机械研磨于一体，且实现同步化。如表1所示，经过D和E的处理，所得到的DNA浓度达到7 ng/μL左右，虽然比其他方法有所提高，但仍停留在个位数。而D和E的处理对DNA纯度的提高则更加明显，所得DNA的OD260/OD280的值都落在1.6～2.1之间，更加接近理想的1.8。

荧光PCR的结果（见表2）和测得的DNA浓度纯度的结果较为吻合，表现为浓度纯度较低的，对应的Ct值大，若浓度纯度相应较高，得到的Ct值则相对小，即相同的样品前处理从A到E，对应荧光PCR测得的Ct值逐步降低，特别是在检测北京白鸭绒和波兰白鸭绒的鸭成分时，A处理检测得到的Ct值在37左右，B和C在32～35之间，D和E则在30左右，阳性增强的趋势较明显。在检测东北白鹅绒的鹅成分时，只有A处理的Ct值高达37.7，B和C处理的Ct值降至30左右，D和E处理的Ct值则都接近28，也充分体现了DNA的品质对PCR检测的重要性。

根据以上检测结果，D和E的前处理往往能得到浓度和纯度较高的DNA，而相应PCR结果的阳性也较强。但D处理同时需要仪器振荡研磨处理和人工液氮研磨处理，工序相对繁琐，因此在后续的试验中，不特别说明的情况下，我们选择E处理作为统一的前处理方式，以此比较不同抽提试剂盒的DNA抽提性能。

此外，从不同物种的检测结果看（表2），鸭绒和鹅绒中都没有检测到鸡源性成分，鸭绒中只检测到鸭源性成分，但在检测鹅绒的时候，发现鹅绒中不但检测到鹅源性DNA，还检测到了鸭源性DNA成分，但Ct值较高在35左右。

2.2 不同抽提试剂盒对DNA质量的影响

在前处理都相同的情况下，比较了不同试剂盒的DNA提取效率。如表3所示，K1试剂盒提取的DNA质量与表2中对应的值接近，即DNA浓度在7ng/μL～10ng/μL之间，OD260/OD280的值在1.5～2.0之间。K2试剂盒抽提得到的DNA，浓度有较大幅度的提升，最低的浓度也达到了19.8 ng/μL，而最高浓度则达到了28.7ng/μL，但该处理的DNA纯度不高，OD260/OD280值较低，介于1.1～1.4之间，该方法虽然DNA的得率较高，但同时也未能有效去除蛋白质、酚等的污染。K3和K4用的都是QIAamp的试剂盒，抽提得到的DNA品质也相仿，即浓度多在10ng/μL～15 ng/μL之间，OD260/OD280值在1.6～1.9之间，虽然这两种处理得到的DNA浓度只有K2处理的一半，但纯度较高，即OD260/OD280的值都接近理想的1.8。

在随后的荧光PCR检测中，也证实了虽然K2处理所得到的DNA浓度较高，但检测得到的Ct值并没有比K3、K4处理有更多优势。如表4所示，K3、K4的Ct值在24～26之间，低于K2处理的26～27之间，说明与浓度一样，DNA的纯度对PCR的扩增同样重要。而K1处理检测到的Ct值和表2中对应的值接近，该试剂盒的表现较为稳定。

表4中荧光PCR的物种检测结果和表3的一致，即：鸭绒中只检测到鸭的DNA成分；鹅绒中除了检测到鹅的DNA，还检测到了鸭的DNA，而这次鹅绒中鸭源性成分的Ct值也达到了30左右，阳性明显。

经过上述试验，我们发现本试验中抽提试剂盒对DNA抽提效率的影响要大于前处理对抽提效率的影响，因此，为了简化操作又增加了前处理A与K3、K4试剂盒的组合，即仅将羽绒剪小剪碎处理的情况下，检测试剂盒提取效率，且K3、K4试剂盒提取时在裂解液中统一处理3h。提取的结果如表5所示：不进行前处理对K3试剂盒抽提得到DNA的浓度影响不大，但对纯度影响较大，OD260/OD280值达到了3左右，可能存在大分子杂质产生了光吸收，或存在RNA杂质；K4抽提得到的DNA，不经过前处理（A前处理）与经过E前处理比较，浓度下降40%左右，表示纯度的OD260/OD280值也从比较完美的1.8左右升至2.0以上。尽管如此，从荧光PCR的检测结果看（表6），鸭绒中鸭成分的Ct值在25～27之间，鹅绒中鹅成分的Ct值在27～30之间，鹅绒中鸭成分的Ct值在31左右，虽然比对应的经过E处理的Ct值都有所升高，但扩增曲线阳性特征明显（图略），可以满足物种鉴定的检测需求。因此在后续的对其他样本的检测中，我们采用了前处理A（无前处理）和K4的组合。

2.3 对11个鸭绒、鹅绒样本的物种成分检测

在对其余11个样本检测后，发现即便不经过研磨等前处理，DNA浓度在8ng/μL～14ng/μL之间，浓度尚可（见表7）。但OD260/OD280值低至1.2，或者高至2.8，偏离1.8的理想值较远。特别是灰鸭绒和灰鹅绒，相比较白鸭绒和白鹅绒，所抽提得到的DNA的纯度更低，这可能是不能有效除去灰绒的色素所导致。但所有抽提得到的DNA都能满足荧光PCR检测的需求：11个样品荧光PCR检测得到目标物种的Ct值在27～31之间，灰鸭绒、灰鹅绒的Ct值高于白鸭绒、白鹅绒的Ct值，与对应的DNA质量相符。

对11个样品的物种检测发现，所有样本中都未能检测到鸡源性DNA成分，鸭绒中都检测到了鸭，鹅绒中也都检测到了鹅，在一个鹅绒样本中也检测到了鸭的DNA成分。新的发现是，在一个鸭绒的样本中检测到了鹅的成分。鹅绒中检测到了鸭，一般会怀疑以次充好，以价低的鸭绒冒充相对价高鹅绒，但鸭绒中检测到了鹅绒，一般不会是商家有意为之，而往往是因为生产过程中无意识混入。

2.4 标准曲线的绘制及鹅绒中鸭绒含量的计算

对从鸭肉和鹅肉中抽提得到的DNA进行4倍梯度稀释，检测引物探针的灵敏度，并绘制标准曲线，结果显示（表8，图1），当DNA浓度大于等于0.005ng/μL时，鸭和鹅得到的标准曲线的R2值分别为0.9835和0.9815，都较接近0.99，理论上，该浓度以上的检测结果较为可靠（图1）。

按照一定的比例（表9），配制了波兰白鸭绒和东北白鹅绒的混合样，将混合样的DNA进行荧光PCR检测。根据标准曲线计算得到样品中鸭和鹅的浓度，并计算鸭成分占样品的比例，将计算得到的比例和最初设置的比例进行比较。如表9所示，100%的东北白鹅绒（0%鸭质量百分比）中检测到3.7%的鸭成分，理论上鸭质量百分比分别为10%～50%的样品中，分别检测到了11.4%、20.9%、31.7%、44.3%和56.7%的鸭成分，检测值与理论值相近，但都高于理论值。

本研究采用的东北白鹅绒是“90绒”，即保证该批鹅绒中至少90%的成分是鹅绒，其余10%可能是毛片、飞丝等其他成分，也可能是鸭绒或其他陆禽绒。统计了表4、表6和表9中，“100%东北白鹅绒”时检测到的鸭的含量，得到的平均值为5.4%（表9中调整后鸭质量百分比理论值）。假设“100%的鹅绒”中5.4%鸭成分是真实值，则之前所得到的10%～50%的鸭质量百分比的理论值则有待调整，即原来10%的值调整后为 [（10+90×0.054）]%=14.6%，其余以此类推，调整后鸭质量百分比理论值如表9所示。与对应的鸭质量百分比计算值比较发现，虽然两个值并不完全相同，但也较相近，计算值和调整后的理论值的差距在-21.6%到7.6%之间，随着鸭含量的增高，差距有所减小，计算值越靠近理论值。总的来说，本研究计算得到的鸭绒的添加量能准确反映含量变化的趋势，可作为一种有效的辅助手段在品质鉴定时加以采用。利用本研究建立的计算方法，计算了表7中“白鹅绒”样品中鸭的成分，发现鸭绒含量高达10.3%。

3 总结与讨论

比较了各种前处理方法对羽绒中提取DNA的影响，得出：高强度的物理研磨，或者在有液氮条件下的研磨都有助于提高DNA的得率。因此，若实验室具备液氮研磨仪或者振荡研磨仪等设备，建议在抽提前进行一定的研磨处理；但若不具相关设备，手动液氮研磨耗时费力，则建议省略该步，可把重点放到选择合适的提取试剂盒。研究发现，与研磨等前处理相比，DNA提取试剂盒对抽提效果影响更加明显。结合本研究，在具备相关设备的情况下，抽提模式可选择B/D+K3/K4（B或D加K3或K4），否则可选择A+K3/K4的模式，一般两种模式得到的DNA浓度都可达10 ng/μL左右，但前一种模式纯度更高，因此在进行目标物种成分荧光PCR检测时，所得到的Ct值前者24、25左右，后者27、28左右。陈国培等[4]用SDS-异硫氰酸胍-β-巯基乙醇法提取得到的DNA浓度在20ng/μL～200ng/μL之间，明显高于本研究得到的DNA浓度，但陈等所选用的是带毛囊的羽绒，且真正用于提取DNA的仅仅是取样品中的毛囊部位，本研究所采用的是随机选取的完整羽绒，不区分是否带有毛囊；而动物纤维中的DNA主要存在于毛囊部位，毛干中存有少量线粒体DNA[6]，因此得到的DNA浓度低于前者与取样部位有很大关系，但本研究取样的随机性简化了操作，更符合实际检测的需求。

荧光PCR检测结果显示：虽然从羽绒羽毛中抽提DNA的报道不多，但也有一些类似的研究，如从鸟的羽毛基部[6]和羽枝[7]中提取DNA，从哺乳动物的毛发中提取DNA[8]，从羊绒羊毛制品中提取DNA[6]，从人的染色的头发中提取DNA[10]等。上述研究中，邵碧英等[6]和Speller等[7]认为合适的试剂盒可有效地从羊绒羊毛和羽毛中提取DNA；此外，上述报道中还较多地提到了Chelex 100的提取方法，认为该方法可有效地提取哺乳动物毛发中[8]和染色头发中[9]的DNA，该方法操作相对简便，可在后续的研究中进行尝试。

物种特异性检测结果显示，鸭绒、鹅绒中掺杂鸡绒的情况在本次研究的样本中并没有发现，但有发现鹅绒中掺杂鸭绒和鸭绒中掺杂鹅绒的现象。陈国培等[4]对25个鸭绒样品进行鸭源性和鹅源性成分的荧光PCR检测，所有样品都检测到了鸭源性成分，而未检测到鹅源性成分；由于无鹅绒样品，因此检测结果无法体现是否有掺假行为，同时也未对鸡源性成分进行检测。从经济角度而言，鸭绒中掺杂鹅绒，无利可图，应该是一种无意识的混入；鹅绒中掺杂鸭绒，是以次充好，是有经济驱动力的，但若掺入的量很低，则也可能是一种无意的行为，如使用相同的器具或流水线导致的混入。本研究进一步利用荧光PCR定量的优势，对同一样本中两种绒含量的比例进行计算，计算得到的值与预设值（表9中“鸭质量百分比理论值”或“调整后鸭质量百分比理论值”）接近，基本能显现含量变化的趋势。特别是当形态学检测存在困难时，如将幼鸭的鸭绒充当鹅绒时，本方法可作为一种辅助检测方法。

参考文献：

[1]王敦洲. 我国羽绒生产现状及外贸出口展望[J]. 水禽世界，2006（4）： 4-6.

[2]王华雄， 林德康， 付劲. 羽绒及其制品的质量与检验[M]. 北京： 中国纺织出版社， 2000.

[3]朱峰， 翁春艳， 涂貌贞， 等. 我国羽绒羽毛现行标准中羽毛绒种类鉴定方法研究[J]. 中国纤检， 2011（8）： 54-56.

[4]陈国培， 赖心田， 唐复润， 等. 鸭绒及鹅绒制品实时荧光PCR鉴定方法研究[J]. 中国纤检， 2013（12）： 60-62.

[5]Pegels N， González I， García T， etal. Avian-specific real-time PCR assay for authenticity control in farm animal feeds and pet foods. Food Chem. 2014， 1（142）：39-47.

[6]邵碧英， 林志武， 陈文炳， 等. 高效的羊绒羊毛织品DNA提取方法的建立[J]. 生物技术， 2009， 19（5）：38-39.

[7] Speller CF， Nicholas GP， Yang DY. Feather barbs as a good source of mtDNA for bird species identification in forensic wildlife investigations [J]. Investigative Genetics. 2011（2）：16-23.

[8]徐艳春， 马立新， 白素英， 等. 应用PCR方法通过毛发进行哺乳动物性别鉴定[J]. 东北林业大学学报， 2000， 28（6）：72-77.

[9]高林林， 唐晖， 严江伟， 等. 染色毛干mtDNA不同提取方法的研究[J]. 中国法医学杂志， 2006， 21（5）：284-286.

（作者单位：吴姗、虞惠贞、方莹，浙江省检验检疫科学技术研究院；任明兴，绍兴出入境检验检疫局）