颗粒蛋白前体缺失型腹膜巨噬细胞的体外炎症应答

边红艳

(延安大学 医学院, 陕西 延安 716000)



·生命科学·

颗粒蛋白前体缺失型腹膜巨噬细胞的体外炎症应答

边红艳

(延安大学 医学院, 陕西 延安 716000)

探讨颗粒蛋白前体缺失型巨噬细胞的体外炎症反应。选取野生型C57BL/6雄性小鼠6-8周(WT)和PGRN基因敲除雄性小鼠6-8周(KO)为实验动物。向小鼠腹腔内注射1mL6%的淀粉,脱颈法处死小鼠后提取腹膜细胞。用瑞士染色后油镜下观察细胞,用流式细胞仪进行细胞检测,显微镜下观察腹膜巨噬细胞吞噬功能,ELISA法检测腹膜巨噬细胞培养上清中TNF-a和IL-12 因子。WT小鼠和PGRN基因敲除KO小鼠腹膜细胞的数目、形态和种类及巨细胞表面标志物和巨噬细胞吞噬功能均无显著性差异(p>0.05)。PGRN基因敲除KO小鼠来源腹膜巨噬细胞培养上清中前炎性因子TNF-a和IL-12的含量较WT小鼠明显增高。PGRN对腹膜细胞的数目、形态、种类和巨噬细胞表面标志物没有显著影响,但会使巨噬细胞炎症反应增强。

颗粒蛋白前体;巨噬细胞;炎症反应

颗粒蛋白前体(progranulin, PGRN)是由593个氨基酸残基组成的分泌性糖蛋白,人类颗粒蛋白前体基因位于 17q21.32[1]。PGRN分子含有1个信号肽及7个半衔接重复的结构域,每个结构域是由 12个半胱氨酸组成[2-3]。PGRN的生理功能包括抗炎、促进细胞增殖和营养等,并参与多项病理和生理活动,比如损伤修复、炎症反应、代谢调控及生长发育等。

炎症的表现为红、肿、热、痛,是机体对内外环境的有害刺激所产生的一种复杂的生理和病理反应。炎症可以起到保护性作用,也可以引起多种疾病[4]。以往研究表明PGRN具有抗炎作用,能抑制肿瘤坏死因子a诱导的中性粒细胞活化,PGRN敲除的小鼠清除胞内菌的能力下降[5]。腹膜巨噬细胞(PM)在腹膜局部免疫中起着重要作用,本研究中利用PGRN基因敲除小鼠(KO)来源的PM作为模型,探讨PGRN在PM炎症应答中的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

实验动物包括野生型C57BL/6雄性小鼠6-8周(WT)和PGRN基因敲除雄性小鼠6-8周(KO)。试剂包括6%(质量分数)淀粉、RPMI1640培养基、LPS、异硫氰酸硫光素、PGRN蛋白纯化所选试剂、荧光标记的抗小鼠单抗CD11b-PE、荧光标记的抗小鼠单抗F4/80-FITC，LB培养基和ELISA所用试剂等。

1.2 方 法

1.2.1 小鼠腹膜细胞的提取方法[6]首先消毒小鼠腹膜皮肤,然后向腹腔内注射1mL/6%的淀粉,脱颈法处死小鼠(72h后),用75%的酒精浸泡3min后,移至超净台将腹部皮肤剪开小口,用玻璃滴管将完全培养基打入腹腔,将腹腔清洗液离心,4℃保持备用。

1.2.2 瑞士染色 将PEC悬液进行离心浓缩20倍后,用完全培养基重悬细胞,将悬液涂片自然风干,干燥后用瑞士染色,干燥后油镜下观察细胞。

1.2.3 流式细胞术 用1×106/管提取后进行离心,弃上清后进行重悬,分别加入小鼠巨噬细胞抗体F4/80和CD11b进行避光孵育,再离心,去上清,重悬,最后用流式细胞仪进行检测。

1.2.4 腹膜巨噬细胞吞噬功能检测 取PEC接种于培养皿中,然后放于孵箱中,等到腹膜巨噬细胞贴壁后,将未贴壁的洗去,将每皿均加入做过标记的大肠杆菌,避光孵育后,洗去胞外大肠杆菌,荧光显微镜下进行观察。

1.2.5 ELISA法检测腹膜巨噬细胞培养上清中TNF-a和IL-12 用去离子水进行稀释,捕获抗体溶于胞被液中,然后包被过夜,弃去胞被液,酶标板在吸水纸上扣干后,洗7遍,进行封闭,弃掉封闭液,重复上述操作,最后加终止液,上机进行检测。

2 结 果

2.1 WT小鼠和PGRN基因敲除KO小鼠腹膜细胞的数目、形态和种类比较结果

分别提取WT小鼠和PGRN基因敲除KO小鼠腹膜细胞进行细胞数目、形态和种类的观察。WT小鼠腹膜细胞总数为11.42×106,PGRN基因敲除KO小鼠腹膜细胞总数为8.84×106,两组间无显著性差异(p>0.05),见图1。腹膜细胞图片进行瑞士染色,油镜下进行观察发现PGRN基因敲除KO小鼠腹膜细胞中主要含有单核细胞、中细粒细胞、淋巴细胞和肥大细胞,其中单核细胞呈现圆形或椭圆形,呈弱嗜碱性,内有嗜天青颗粒等。WT小鼠和PGRN基因敲除KO小鼠腹膜细胞进行对比,在形态、种类比例中均无显著性差异(p>0.05),见图1和图3。

2.2 巨细胞表面标志物检测

用流式细胞术检测巨细胞表面标志物发现KO组腹膜细胞F4/80和CD11b阳性细胞含量分别是49.7%和91.6%,WT组腹膜细胞F4/80和CD11b阳性细胞含量分别是52.68%和89.44%,两组之间无显著性差异(p>0.05),见图4和图5。

图1 WT小鼠和PGRN基因敲除Fig.1 Number of peritoneal cells of WT mice

图2 WT小鼠和PGRN基因敲除KO小鼠腹膜细胞数目KO小鼠腹膜细胞种类比较Fig.2 Comparison of peritoneal cell types in and PGRN knockout KO mice WT mice and PGRN knockout KO mice WT KO

图3 WT小鼠和PGRN基因敲除KO小鼠腹膜细胞形态比较Fig.3 Morphological comparison of peritoneal cells of WT mice and PGRN knockout KO mice

图4 巨细胞表面标志物F4/80Fig.4 Giant cell surface marker F4/80

图5 巨细胞表面标志物CD11bFig.5 Giant cell surface marker CD11b

2.3 巨噬细胞吞噬能力比较

在荧光显微镜下观察吞噬阳性的巨噬细胞数量,两组间无显著差异p>0.05),见图6。

图6 巨噬细胞吞噬能力比较Fig.6 Comparison of phagocytic capacity of macrophages

2.4 炎性应答结果

ELISA法结果显示,PGRN基因敲除KO小鼠来源腹膜巨噬细胞培养上清中前炎性因子TNF-a和IL-12的含量较WT小鼠明显增高,见图7和图8。

图7 炎性因子TNF-a比较Fig.7 Comparison of inflammatory factors TNF-a

图8 炎性因子IL-12比较Fig.8 Comparison of inflammatory factors IL-12

3 讨 论

PGRN是免疫调节分子中的其中之一,对免疫反应中的关键性信号通路进行调节,对炎症性疾病有抗炎和促炎作用。国外学者Tang等发现PGRN是肿瘤坏死因子受体的新配体,可以结合TNFR的胞外域,而且能够阻断TNF-α介导的 NFκB 等信号通路,从而在类风湿性关节炎中发挥重要的抗炎作用[7-8]。

WT小鼠和PGRN基因敲除KO小鼠腹膜细胞的数目、形态、种类和巨噬细胞表面标志物比较无显著性差异,说明PGRN基因内源性缺失对小鼠腹膜细胞的数目、形态、种类和巨噬细胞表面标志物无明显影响。而且PGRN基因缺失也不会明显影响巨噬细胞吞噬功能。但是，PGRN基因敲除KO小鼠来源腹膜巨噬细胞培养上清中前炎性因子TNF-a和IL-12的含量较WT小鼠明显增高。说明PGRN基因缺失会使炎性因子产生更强的炎症反应。TNF-a是一种重要的免疫调控因子,在炎症反应中处于核心位置[9-10]。本次研究发现,PGRN基因敲除KO小鼠来源腹膜巨噬细胞TNF-a和IL-12因子明显增多,表现出更强的炎症反应。

综上所述,PGRN对腹膜细胞的数目、形态、种类和巨噬细胞表面标志物没有显著影响。但是，会影响巨噬细胞炎症反应,使巨噬细胞炎症反应增强。

[1] 周锦龙,王志豪,李腾,等.颗粒蛋白前体与神经系统疾病[J].生命科学,2016,28(4):493-497.

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(编 辑 徐象平)

The in vitro inflammatory response of granular protein precursor deleted peritoneal macrophages

BIAN Hongyan

(School of Medicine, Yan′an University, Yan′an 716000， China)

To investigate the in vitro inflammatory response of the granular protein precursor. Selection of wild-type 6-8 male mice (6-8) and PGRN (WT) C57BL/6 weeks (KO) in male mice as experimental animals.After intraperitoneal injection of 1ml6% into the mice, the mice were sacrificed and the peritoneal cells were extracted.Switzerland after staining under oil microscope to observe the cell, by flow cytometry for cell detection, under a microscope observation of peritoneal macrophage phagocytic function and ELISA method for the detection of peritoneal macrophage culture supernatant TNF-and IL-12 factor. There were no significant differences in the number, shape, type, and phagocytic function of peritoneal cells of WT mice and PGRN knockout KO mice(p>0.05).The contents of TNF-a and IL-12 were significantly higher in PGRN mice than in KO mice, and the contents of and WT were significantly higher in the supernatant of peritoneal macrophages. PGRN has no significant effect on the number, shape, type of peritoneal cells and the surface markers of macrophages, but it can enhance the inflammatory response of macrophages.

PGRN; macrophage; inflammatory reaction

2015-11-17

陕西省自然科学基金资助项目(2013K12-01-23)

边红艳，女，陕西延安人，从事生命科学及疾病相关性研究。

R364.5

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-05-016