泡菜发酵过程中菌相变化的研究

闫颖娟， 夏秀东， 李爱茹，董明盛*

(1.忻州师范学院生物系，山西忻州034000；2.南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095；3.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014)



泡菜发酵过程中菌相变化的研究

闫颖娟1,2， 夏秀东3， 李爱茹2，董明盛2*

(1.忻州师范学院生物系，山西忻州034000；2.南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095；3.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014)

[目的]研究泡菜发酵过程中的菌相变化过程。[方法]以自制泡菜为研究对象，利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对泡菜发酵过程中和泡菜成品的菌相进行了分析。[结果]发酵过程中的泡菜电泳图上的条带从发酵第1天的13条逐渐减少到第4天的11条再到第7天的9条，而泡菜成品中的条带则只有明显的2个条带。[结论]随着发酵过程的进行，泡菜最初的杂菌逐渐被优势菌抑制并最终取代。

发酵；泡菜；聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳

泡菜是一种独特的乳酸发酵蔬菜制品，人们经常食用，可摄入大量的乳酸菌及乳酸等代谢产物，它们能调节肠道微生态平衡，达到预防疾病和保健的目的[1]。通过对国内外若干种含有乳酸菌的药物及口服液等商品进行活菌数检测表明，泡菜汁中活乳酸菌数远远高于此类商品，而且价廉物美、食用方便。家庭制作泡菜，不仅可作为传统佐食，而且可成为具有我国传统特色的、廉价的、高效的天然微生态调节剂，这对提高我国人民身体健康水平有着积极的意义。但是，由于植物本身就带有大量的微生物，所以在腌制过程中除乳酸菌生长繁殖以外，还会有多种微生物同时生长，对泡菜的风味和质量有较大的影响。因此，对泡菜发酵过程中菌相的变化进行深入研究有着重要的意义。

变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)是目前研究微生物遗传多样性和种群动态性最有力的分子生物学技术。1993年，Muyzer等[2]首次将该技术应用于微生物生态的研究，在近10年的时间里已被广泛应用于各种环境微生物生态的研究。DGGE 的原理是在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，DNA 双链一旦解链，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降。因此，将聚合酶链式反应(PCR)扩增得到的等长DNA 片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的DNA 片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度急剧下降，停留在与其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现分开的条带[3]，可以直接用来分析细菌染色体基因[4]。采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)测定方法可以取代传统的纯培养方法，克服了采用选择培养基进行菌种分离时的种种困难。所以笔者选用PCR-DGGE的方法对泡菜发酵过程中菌相的变化进行分子生物学方面的鉴定，为进一步深入了解泡菜这一自然发酵过程，寻找如何减少杂菌生长的方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 原料：白菜，购自苏果超市；泡菜成品发酵液，南京农业大学微生物实验室提供。主要仪器：LRH-150型生化培养箱，上海益恒实验仪器有限公司；YJ-875型医用净化工作台，吴江市生化净化设备厂；DJ300型电子天平，中国轻工业机械总公司常熟衡器工业公司；手提式高压蒸汽消毒器，上海医用核子仪器厂；DUG-9140型电热恒温鼓风干燥箱，上海益恒实验仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；WD900型微波炉，顺德市格兰仕电器实业有限公司；DYY-2C型电泳仪，北京市六一仪器厂；FR-980型电泳图像分析系统，上海复日科技有限公司；PCR仪、DGGE变性梯度凝胶电泳系统，Bio-Rad；D-37520型离心机，Osterode德国。主要试剂:PCR试剂盒和DNA Marker均购自北京清华天为生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 泡菜的制作。将大白菜切分装入三角瓶中压实，倒入含3%白砂糖、2%食盐的水溶液，封瓶放入28 ℃培养箱发酵7 d。

1.2.2 菌种的分子生物学鉴定。

1.2.2.1 基因组DNA提取[5]。取样：每天从三角瓶中提5 mL的发酵液加入离心管中，离心12 500 r/min转5 min，去上清后，用5 mL无菌水重悬沉淀，再离心12 500 r/min转5 min，去上清，做2～3个重复；加入500 μL TES缓冲液(含有20 mg/mL溶菌酶)，37 ℃水浴锅保温0.5 h后，加入125 μL 20%的SDS提取液， 37 ℃水浴锅中保温15 min；加入等体积的酚-氯仿，混匀，离心7 000 r/min转5 min，待分层后，取上层(重复3次氯仿抽提)；加入等体积的异丙醇，沉淀DNA，放入-20 ℃冰箱0.5 h；离心12 500 r/min转30 min，取沉淀，去上清，加入1 mL 70%乙醇，重悬沉淀，离心12 500 r/min转5 min，去上清，离心管倒置至无水珠挂壁，加入50 μL TES缓冲液，放入-18 ℃冰箱备用。

1.2.2.2 琼脂糖凝胶电泳。称取1.0 g琼脂糖，加100 mL电泳缓冲液(1×TAE)加热熔化，直至完全溶解呈透明，胶液冷至60 ℃时，加入EB贮存液5 μL，混匀，缓慢浇注于制胶模板上，在胶一端插上梳子，待胶体凝固后，拔出梳子，将模具置于电泳槽中，加入1×TAE缓冲液，液面高于胶面2～3 mm，DNA样品中以1∶5加入加样缓冲液，上样，接通电源100 mV，电泳1 h，切断电源，取出凝胶，FR-980电泳图像分析系统观察拍照。

1.2.2.3 PCR引物及反应体系。细菌通用引物为EUB-338GC for：5′>CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG <3’；EUB-518 rev：5′> ATT ACC GCG GCT GCT GG < 3′。

PCR反应体系：2 μL DNA，2 μL EUB-338GC，2 μL EUB-518，5 μL PCR Buffer，4 μL dNTP，0.5 μLTaqDNA 聚合酶，34.5 μL ddH2O，总体积为50 μL。PCR反应参数：模板热变性在94 ℃下反应5 min，模板热变性在94 ℃下10 s， 56 ℃下退火20 s ，68 ℃下延伸40 s，共进行35次循环，最后68 ℃下延伸7 min。产物检测：同琼脂糖凝胶电泳。

1.2.2.4 DGGE变性梯度凝胶电泳。将大、小2块玻璃板，2个间隔条，1个样品梳洗净干燥待用，用夹子夹住；底部涂上一层薄的凡士林，移至固定架的橡皮条上固定；用不同体积的2种丙烯酰胺贮存液配制要求浓度的变性分离胶、浓缩胶；清洗梯度合成器并干燥，并关掉两糟之间的活栓，将出口针头置于大小玻璃之间并固定；将高低2种浓度的变性剂溶液加入10%过硫酸胺(APS)50 μL后加到梯度合成器的左右槽中；打开恒流泵开关以及两槽的开关，分离胶灌完后，将针头移至废液瓶，冲洗梯度合成器的两槽，开泵排出水分，关闭活栓并擦干；在浓缩胶中加入10% APS 50 μL，并将浓缩胶加入左槽；打开梯度合成器的泵，先用19 mL/min速度直至浓缩胶运行至距离针头约1 cm处，再用1.1 mL/min速度，以后逐渐增大到3.0 mL/min将浓缩胶灌入2层玻璃之间；浓缩胶充满后，在其的顶部插入样品梳，凝固1 h以上。在电泳槽中加入新配制的电泳缓冲液(0.5×TAE)，打开电泳仪预热以使得电泳缓冲液温度达到60 ℃；去掉梳子，用电泳缓冲液冲洗加样槽和胶底部的凡士林，并将其固定在电泳槽内；点样(PCR产物与加样液缓冲液5∶1混合)；盖上电泳仪的盖子，电泳，先200 V，10 min，随后85 V，16 h；将胶体从电泳槽中取出后放在塑料容器中，加入200 mL Cairns′固定液，摇3 min；将Cairns′固定液倒在容器中(备用)；添加200 mL银染溶液在摇床上摇10 min；弃去银染溶液，用蒸馏水清洗胶及容器；添加新鲜蒸馏水，添加显影液，直至条带清晰为止；弃去显影液，加入Cairns′固定液，摇5 min；弃去固定液，加入蒸馏水，摇2 min，弃去蒸馏水，加入Cairns′保存液，摇7 min；取出胶体置于洁净玻璃板上，干燥，扫描。

2 结果与分析

2.1 发酵液基因组DNA的提取 从泡菜发酵过程中的发酵液中提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳。图1结果表明，从发酵泡菜和成品泡菜中提取的DNA条带清晰，说明该试验所用DNA提取方法适用于发酵泡菜中细菌DNA的提取。DNA条带下方亮条带是RAN条带，不会影响后续试验。

注：EP.成品；1～7.从第1～7天的发酵液中提取的DNA。Note:EP.end product; 1-7.DNA extracted from pickles juice from day 1 to day 7.图1 泡菜发酵液DNA电泳图谱Fig.1 Electrophoregrams of DNA in pickle juices

2.2 16S rDNA可变区DNA扩增 针对不同菌种的16S rDNA可变区含有不同的碱基对，以此为靶基因用PCR-DGGE进行区别。先将提取的DNA进行PCR扩增，获得PCR产物。如图2所示，试验所提取的泡菜发酵液DNA经PCR扩增，其产物的大小为200～300 bp，小于500 bp，可进行DGGE电泳。

注：EP.成品；1～7.从第1～7天的发酵液中提取的DNA。Note:EP.end product; 1-7.DNA extracted from pickles juice from day 1 to day 7.图2 16S rDNA可变区DNA扩增凝胶电泳Fig.2 Electrophoregrams of 16S rDNA

2.3 PCR-DGGE分析 图3是泡菜成品以及发酵第1～7天产物的DGGE图谱，图谱上的泳带反映了发酵过程中的优势菌群，泳带数量和位置的复杂性说明了菌群的多样性。该试验通过对发酵过程中的不同时期发酵产物DGGE分析，来监测发酵液中细菌群体变化过程。图3显示，发酵过程中的发酵产物在同一DGGE凝胶上进行图谱分析表明，发酵产物第1天的一些优势泳带在发酵第5天时消失。另一方面，没有新的泳带在第5天后出现。从总体看，随时间延长，条带的数量逐渐减少。可以看出，在发酵前4 d内，DGGE图谱有变化，而在发酵第5天样本DGGE间的相似值最高，看不出有显著的变化，这与赵书欣等[6]的研究结果一致，发酵时间应为5 d，第5天后其细菌群体变化速度较稳定。这些结果说明，泡菜发酵过程中细菌群体在发酵前4 d内有变化，而后缓慢，这可能是大多数杂菌的生长受到了抑制，逐渐被优势菌落所取代的结果。然而，泡菜成品仅有2条清晰的条带，可知此产品中已经没有杂菌，只剩下了2个菌群。这可能是由于发酵泡菜在储藏过程中优势菌继续生长，杂菌被进一步抑制而造成的。

注：EP.成品；1～7.从第1～7天的发酵液中提取的DNA。Note:EP.end product; 1-7.DNA extracted from pickles juice from day 1 to day 7. 图3 PCR-DGGE电泳Fig.3 Electrophoregrams of PCR-DGGE

3 结论与讨论

国外有的学者在应用DGGE进行研究时，对得到的DGGE单个条带测序从而进行系统发育分析，其结果与直接形态观察或纯培养结果均呈现出一致性，证明了DGGE是一种快速、可靠的方法[7-8]。该试验利用DGGE检验了泡菜在发酵过程中的菌相变化，但未进行DNA的测序，不能确定具体的菌种，也无法详细分析泡菜发酵过程中优势菌落，以及杂菌的类别。但赵书欣等[6]的研究结果证明，这些菌落为乳酸菌、芽孢杆菌、假单胞菌、肠杆菌属欧文氏菌等。在后续试验中应进行DNA的测序、鉴别菌种，并寻找适合优势菌群快速生长的发酵条件，确定发酵过程中的动态参数，对发酵过程进行监控。

Vallaeys等[9]发现，DGGE法并不能对样品中所有的DNA片段进行分离。Muyzer等[2]指出，DGGE法只能对微生物群落中数量上大于1%的优势种群进行分析。因此以上分析具有一定的局限性，同时由于不同的菌落所需的溶菌酶的不同，以及PCR引物的不同，都会对图谱产生影响。理论上，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，DGGE技术对于DNA片段的分辨率可以达到一个碱基差异水平，所以PCR-DGGE技术在菌落分析中仍大量使用。该研究结果表明，在泡菜的发酵过程中细菌群体在发酵前4 d内有变化，而后缓慢，电泳图上的条带从第1天的13条到第4天的11条再到第7天的9条，说明发酵开始时的大多数菌群在发酵过程中逐渐被优势菌所取代。

泡菜在发酵初期含有大量的杂菌，在发酵过程中优势菌会抑制杂菌的生长，并最终取代杂菌；在该泡菜制作条件下发酵4 d便可使发酵泡菜体系中的菌相达到稳定状态，但是泡菜经储藏后优势菌会进一步抑制其他细菌并最终占绝对优势。

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Study on Microflora Changes during Fermentation of Pickles

YAN Ying-juan1,2,XIA Xiu-dong3,LI Ai-ru2,DONG ming-sheng2*

(1.Department of Biology,Xinzhou Teachers University,Xinzhou,Shanxi 034000; 2.College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing,Jiangsu 210095; 3.Institute of Agro-product Processing,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing,Jiangsu 210014)

[Objective] In order to analyze the changes of microflora during the fermentation of pickles.[Method] With homemade pickles as research object,denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) was applied.[Result] The results showed that the strips were gradually reduced from 13 strips at day 1 to 11strips at day 4 and to 9 strips at day 7.There were only 2 strips in the end product.[Conclusion] The original mixed bacteria were gradually replaced by do minant bacteria.

Fermentation; Pickles; PCR-DGGE

国家自然科学基金青年基金项目(31501460)。

闫颖娟(1987- )，女，山西忻州人，讲师，硕士，从事发酵工程研究。*通讯作者，教授，博士生导师，从事食品微生物与发酵工程研究。

2016-09-14

TS 201.3

A

0517-6611(2016)31-0037-03