丹参酮ⅡA对压力超负荷大鼠心肌血红素加氧酶-1 mRNA基因表达的作用※

蔡 辉 朱凯媛 赵凌杰 赵智明 董晓蕾 张蓓蓓

(中国人民解放军南京军区南京总医院中西医结合科，江苏 南京 210002)



丹参酮ⅡA对压力超负荷大鼠心肌血红素加氧酶-1 mRNA基因表达的作用※

蔡 辉 朱凯媛 赵凌杰 赵智明 董晓蕾 张蓓蓓

(中国人民解放军南京军区南京总医院中西医结合科，江苏 南京 210002)

目的 观察丹参酮ⅡA(TanⅡA)对压力超负荷大鼠心肌血红素加氧酶-1(HO-1)mRNA基因表达的影响，并探讨其对心肌纤维化、心室重构的保护作用。方法 40只SD大鼠随机抽取8只为假手术组，其余32只大鼠为手术组采用腹主动脉缩窄术制备压力超负荷模型，术后手术组存活的22只大鼠再随机分成3组，分别为模型组(n=7)、TanⅡA组(n=7)及TanⅡA+HO-1抑制剂处理组[TanⅡA+锌原卟啉(ZnPP)注射液组，n=8)。造模术后第4周开始给药，假手术组、模型组均以0.9%氯化钠注射液4 mL/(kg·d)腹腔注射；TanIIA组以丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)注射液20 mg/(kg·d)腹腔注射；TanIIA+ZnPP组以STS注射液20 mg/(kg·d)+ZnPP注射液1 mg/(kg·d)腹腔注射。各组每日上午给药1次，疗程为4周。检测4组大鼠心肌组织HO-1mRNA基因表达，观察大鼠心肌组织结构变化。结果 TanⅡA组HO-1 mRNA基因表达高于其余3组(均P<0.01)，当使用HO-1抑制剂ZnPP注射液后可见HO-1 mRNA基因表达较TanIIA明显下降(P<0.01)。光镜下假手术组大鼠心肌纤维排列整齐、横纹明显，胞核结构清晰，无坏死灶，心肌间质及微血管正常；与假手术组比较，模型组心肌纤维明显增粗且排列紊乱，部分胞核固缩，并有局灶性、片状坏死灶和炎性细胞浸润，血管周围及间质有胶原纤维的沉积；TanIIA组和TanIIA+ZnPP组心肌的组织形态学均有不同程度改善，而TanIIA组改善更明显。结论 TanⅡA可以抑制心肌纤维化，减缓心室重构，此作用可能与TanIIA诱导HO-1过表达有关。

疾病模型，动物；心肌；丹参酮；血红素加氧酶-1；心室重构

丹参酮ⅡA (TanshinoneⅡA，TanⅡA)作为传统中药丹参中脂溶性成分的基本结构，具有清除自由基、抗氧化、抑制胶原纤维产生、促进纤维蛋白降解、减轻心肌缺血再灌注损伤、抑制血小板凝聚和血栓形成等多项作用[1-2]。然而，TanⅡA这种保护作用的分子机制尚不明确[3]。血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)作为血红素分解代谢的关键酶，HO-1作为其诱导型酶，具有明显的保护器官和组织等作用[4]，TanⅡA是否可以通过诱导HO-1的过表达，起到保护细胞的作用，目前尚未见报道。本研究拟通过建立压力超负荷大鼠模型，探讨TanⅡA和HO-1 mRNA基因表达之间的关系及TanⅡA对压力超负荷大鼠心室重构的影响，以期为延缓心室重构提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠40只，6周龄，体质量180～200 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK(沪)2013-0016。动物房温度20～25 ℃，湿度40%～60%，光照时间8：00～20：00，保持实验室内通风良好。饲料、垫料高压灭菌处理，常规给予饲料喂养，保持所有大鼠自由进食、饮水。

1.1.2 试剂与药品 Trizol购自美国Invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；SYBR荧光染料试剂购自日本 TOYOBO公司；Agarose购自西班牙Biowest公司；氯仿、异丙醇、10%水合氯醛、10%甲醛均购自南京化学试剂股份有限公司；丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)注射液(2 mL:10 mg)购自上海第一生化药业有限公司；锌原卟啉(ZnPP)注射液购自美国 Sigma公司。

1.2 实验方法1.2.1 压力超负荷大鼠模型制备 将40只SD大鼠常规饲养1周后，按照随机数字表法给大鼠编号，8只为假手术组，其余32只为手术组，手术组大鼠术前禁食12 h，先将SD大鼠用浓液10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)行腹腔注射麻醉，后采用腹主动脉缩窄法制备压力超负荷模型，术后6 h恢复饮食。术后3 d内给予注射用青霉素钠腹腔注射(4 000 U/kg)预防感染。假手术组除不结扎腹主动脉外，余处理同手术组。术后3 d，检测尾动脉血压，血压较前升高20%视为造模成功，连续观察4周。1.2.2 分组及给药 造模4周后，手术组大鼠共死亡10只，主要死因为急性心力衰竭，假手术组(n=8)全部存活。将术后存活的手术组大鼠按随机数字表法分为模型组(n=7)、TanⅡA组(n=7)及TanⅡA组+HO-1抑制剂组(TanⅡA+ZnPP组，n=8)。假手术组、模型组均以0.9%氯化钠注射液4 mL/(kg·d)腹腔注射；TanⅡA组以STS注射液20 mg/(kg·d)腹腔注射；TanⅡA+ZnPP组以STS注射液20 mg/(kg·d)+ZnPP注射液1 mg/(kg·d)腹腔注射。各组每日上午给药1次，连续给药4周，观察大鼠的饮食、活动、精神、毛色及水肿等情况，每周称取体质量1～2次。 1.2.3 观察指标 观察4组大鼠心肌组织HO-1 mRNA基因表达及大鼠心肌组织结构变化。

1.2.4 HO-1 mRNA的实时定量PCR检测 取心肌组织40 mg加入Trizol液1 mL，按Trizol试剂说明书进行抽提总RNA，测定RNA浓度和纯度，逆转录cDNA，以Real-time PCR技术检测心肌组织中HO-1的表达水平，总的反应体系20 μL：2X Real-time PCR Master Mix(SYBR Green)10 μL、模板(cDNA稀释10倍)1 μL、引物MIX( F/ R各为10 μm)2 μL、0.1%二乙基焦磷酰胺(DEPC水) 7 μL。在PCR反应体系中，一个样本基因做3个复孔。目的基因大鼠HO-1正义引物5'- GTAAAGCGTCTCCACGAGGT -3'，反义引物5'- ACCCAGGTAGCGGGTATATG -3'，扩增片段长度为75 bp。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)正义引物5'- GGCCTTCCGTGTTCCTACC -3'，反义引物5'- CGCCTGCTTCACCACCTTC -3'，扩增片段长度为103 bp。细胞内mRNA表达水平以相应标本内GAPDH mRNA为基准采用2^-△△CT方法计算，并将假手术组标本内目的基因表达水平设为1，对其他组标本内目的基因表达水平进行标准化。

1.2.5 心脏病理组织学检测 左室心肌标本于10%甲醛溶液中固定24 h后，常规取材、脱水、石蜡包埋，沿左室长轴线每隔1 mm横断面切取数张厚约4 μm的组织切片，行苏木精-伊红染色法(HE)染色。在光学显微镜下观察各组心肌细胞形态。

2 结 果

2.1 4组大鼠心肌组织HO-1mRNA基因表达的比较 见表1、图1-2。

组 别n2^-△△CT假手术组81.00±0.04*模型组75.98±0.40*TanⅡA组78.35±0.34TanⅡA+ZnPP组82.50±0.05*

与TanⅡA组比较，*P<0.01

HO-1线性扩增图谱

GAPDH线性扩增图谱

HO-1对数扩增图谱

GAPDH对数扩增图谱

HO-1熔解曲线 GAPDH熔解曲线

图1 各组大鼠心肌组织HO-1 mRNA与GAPDH的线性、对数扩增图谱及熔解曲线

图2 各组大鼠心肌组织HO-1 mRNA基因表达水平比较

由表1及图1、2可见，采用Real-time PCR技术，检测各组大鼠心肌组织HO-1 mRNA扩增CT值，通过2^-△△CT计算目的基因含量。从扩增的荧光曲线及熔解曲线可以看出，曲线大部分拟合良好，CT值接近，说明PCR体系稳定、模板分配均匀、样品的重复性较好，扩增效率基本一致，结果可靠。TanⅡA组HO-1 mRNA基因表达高于其余3组(均P<0.01)，当使用HO-1抑制剂ZnPP注射液后可见HO-1 mRNA基因表达较TanⅡA明显下降(P<0.01)。

2.2 4组大鼠心肌组织结构变化比较 见图3。

图3 4组大鼠心肌组织结构变化(HE，×200)

由图3可见，假手术组大鼠心肌纤维排列整齐、横纹明显，胞核结构清晰，无坏死灶，心肌间质及微血管正常；与假手术组比较，模型组心肌纤维明显增粗且排列紊乱，部分胞核固缩，并有局灶性、片状坏死灶和炎性细胞浸润，血管周围及间质有胶原纤维的沉积；TanⅡA组和TanⅡA+ZnPP组心肌的组织形态学均有不同程度改善，而TanⅡA组改善更明显。

3 讨 论

心室重构是指心肌对容量或压力超负荷引起的代偿性、适应性改变，包括心肌细胞肥大、间质纤维化和细胞凋亡等，逐步进展为心力衰竭。心室重构的发生不仅表现为几何形态学改变，也体现在细胞间信号传导、细胞外基质及基因表达改变上，是许多严重心血管疾病末期的共同通路。而氧化应激在心室重构的发生发展过程中发挥着重要作用，活性氧可以通过多种途径促进心肌肥厚、间质纤维化和心肌细胞凋亡，从而导致心室重构。

近年来研究发现，许多中药对抑制心室重构具有保护作用[5-6]，我国学者从中药中筛选出高效低毒的药物以减少压力超负荷引起的心室重构损害，丹参便是其中之一。研究表明，丹参具有清除氧化自由基、抑制炎症反应、改善血液动力学及微循环、有效减轻器官的缺血再灌注损伤等作用，TanⅡA是丹参中含量最丰富、结构最具代表性的丹参酮，可通过降低还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性，减少活性氧产生，减弱氧化应激，从而有效抑制大鼠心室重构的发展[7-8]。

HO系统是血红蛋白降解的起始酶和最重要的限速酶，与心血管疾病有着密切联系[9]。它主要有3种同工酶：HO-1、HO-2和HO-3，其中以诱导型酶HO-1作用最为显著，HO-1位于人染色体22q12，相对分子量为32 000，可以通过转化血红素产生一氧化碳(CO)、铁离子和胆绿素[10]，主要分布于单核细胞胞质微粒体，在网状内皮细胞含量丰富的组织如肝、脾等也有少量分布。生理条件下HO-1表达水平很低，但可被多种有害刺激所诱导，包括氧化应激、炎症、热休克、重金属、高温及内毒素等[11]。Zeng B等[12]研究发现HO-1在间充质干细胞(MSCs)过表达影响血管生成和改善心肌梗死后心肌功能，与对照组比较，HO-1-MSCs组凋亡细胞明显减少，左室扩张度和纤维化程度均显著降低，左室前壁厚度更薄。超声心动图结果进一步证实了HO-1可通过修饰MSCs显著改善左室重构。Allwood MA等[13]研究证实在急性压力情况下HO-1的表达升高对细胞有明确的保护作用，HO-1酶活性减弱氧化应激和炎症，促进新血管形成，并与心血管疾病的发生发展呈负相关。通过研究HO-1基因敲除小鼠模型和HO-1缺失患者进一步支持了HO-1对心肌细胞的保护作用。Tiwari S 等[14]研究表明HO-1缺乏与氧化应激增加和相关病理结果联系密切。与对照组比较，HO-1基因敲除小鼠随着慢性缺氧右心室严重扩大。另外，HO-1缺失的胚胎成纤维细胞更易受氧化刺激增加损伤和死亡，从而证明了HO-1在氧化应激中的有益作用。目前丹参和HO-1的关系研究国内外报道较少，Chen TH等[15]实验证明，TanⅡA 可以诱导RAW264.7巨噬细胞内HO-1过表达，其抗炎作用可能是通过其诱导HO-1过表达实现的。

本实验研究结果表明，TanⅡA组的HO-1 mRNA的基因表达明显高于其余3组，表明TanⅡA对大鼠心肌组织细胞HO-1的表达有明显的诱导作用，病理切片结果显示，TanⅡA组心肌纤维化程度较模型组明显改善。用HO-1抑制剂ZnPP注射液按1 mg/(kg·d)腹腔注射作对照，结果发现HO-1 mRNA的表达明显降低，HE染色结果显示心肌纤维化程度改善程度不如TanⅡA组明显，说明TanⅡA有保护心肌细胞、抑制心肌纤维化、延长心室重构的作用。当ZnPP抑制了HO-1的过表达后，TanⅡA对心肌细胞的保护作用减弱。相关性分析结果表明，当HO-1表达与心肌纤维化程度呈负相关时，TanⅡA在大鼠心室重构中的保护作用是通过对HO-1的诱导来实现的。

综上所述，TanⅡA对大鼠压力超负荷引起的心肌纤维化具有明显的效果，可以延缓大鼠心室重构的时间。其作用除了抑制心肌细胞肥大、减弱氧化应激、抑制信号通路外，还可能与诱导HO-1的过表达，通过HO-1来实现这种保护作用有关。本实验以期为临床心室重构时间的延长提供实验依据，为开发新药提供理论基础。

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(本文编辑：习 沙)

Study of Tanshinone-IIA on the expression of myocardium hemo oxygenase-1 mRNA in pressure-overloaded rats

CAIHui,ZHUKaiyuan,ZHAOLingjie,etal.

DepartmentofIntegratedChineseandWesternMedicines,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommandofPLA,Jiangsu,Nanjing210002

Objective To observe the Tanshinone-IIA (TanIIA) on the expression of myocardium hemo oxygenase-1 (HO-1) mRNA in pressure-overloaded rats, and to investigate its protection of myocardial fibrosis and ventricular remodeling. Methods 40 SD rats were randomly selected 8 for control (sham group), the remaining 32 rats were prepared for abdominal aortic constriction pressure-overloaded model. Postoperative survival 22 rats were randomly divided into model group (n=7), TanIIA group (n=7) and TanIIA+HO-1 inhibitor group (TanIIA+ZnPP group,n=8). Four weeks after the operation, the model was successfully made and began to give medicine for four weeks.The sham group and the model group received intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride injection (4mL·kg·d).The TanⅡA group received intraperitoneal injection of TanⅡA sulfonate sodium injection (20mg·kg·d). The TanⅡA +ZnPP group received TanⅡA sulfonate sodium injection (20mg·kg·d) combined with ZnPP injection (1mg·kg·d).The expression of HO-1 mRNA in myocardium was detected, and the pathological HE staining was done at the same time. Results The expression of HO-1 mRNA in TanIIA group was higher than the other three groups (P<0.01). The expression of HO-1 mRNA in TanIIA+ZnPP group was obviously decreased as compared with TanIIA group (P<0.01). Myocardial fibrosis in sham operation group arranged irregularly, visible cross striations, clear nuclei, without necrosed tissue, and with normal myocardial interstitium and micrangium. As compared with the sham operation group, the myocardial fibrosis in model group became denser and malalignment, some nucleolus shrinked, with focal and patchy necrosis, inflammatory cell infiltration, deposition of collagen fibers around vessel and mesenchyme.There were different improvements of myocardial tissue morphology in TanIIA and TanIIA+ZnPP group, and the improvement in TanIIA group was more obvious. Conclusion TanIIA can inhibit myocardial fibrosis and reduce ventricular remodeling, which may be related with the TanIIA-induced over-expression of HO-1.

Disease models; Animals; Myocardial; Tanshinone; Hemo oxygenase-1; Ventricular remodeling

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.09.018

※ 项目来源：南京总医院科研基金面上课题(编号：2014016)

蔡辉(1959—)，男，教授，博士。从事中西医结合临床研究工作。

R-332；R-33；R284.1

A

1002-2619(2016)09-1348-05

2016-02-26)