黄曲霉素B1对鸡骨髓源树突状细胞成熟能力的影响

孙志永 姚海飞 陈奇 袁永莉



黄曲霉素B1对鸡骨髓源树突状细胞成熟能力的影响

孙志永①姚海飞②陈奇③袁永莉②

（①江苏省洪泽县动物卫生监督所 223100 ②江苏省洪泽县动物疫病预防控制中心 ③江苏省清浦区动物卫生监督所）

黄曲霉素B1是威胁家禽养殖业的主要毒素之一，然而对禽免疫细胞-树突状细胞的免疫功能调控尚不明确。本试验通过B1作用体外诱导培养的鸡树突状细胞，测定其表型标志CD40和CD86的表达情况。结果发现，B1作用树突状细胞24h后，显著上调了CD40和CD86的表达(P<0.05)，却显著下调MHCII的表达(P<0.05)。表明B1促进鸡树突状细胞不完全的功能成熟。

黄曲霉素 鸡树突状细胞 表型

禽饲料中的黄曲菌能够产生大量的黄曲霉素。黄曲霉素B1是其主要形式。在家禽中，B1可以引起家禽胃肠道前段的腺胃和肌胃发生炎症、肝毒性、血液毒性等。此外，B1对免疫系统也具有抑制作用，是导致家禽疫苗免疫接种频频失败的重要原因[1]。

树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是激活宿主早期天然免疫和后期获得性免疫的重要抗原提呈细胞[2]。在家禽中，DCs的免疫功能，特别是功能成熟方面，是保证各种疫苗免疫效力的关键。因此本研究旨在阐明黄曲霉素B1对鸡DCs成熟功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

黄曲霉素B1从A. flavus NRRL 5518菌株纯化(美国国家利用研究中心)。完全细胞培养液：细胞培养基(RPMI1640，life)、抗生素(青链霉素，南京生兴)、10%胎牛血清(Gbico)、重组鸡GM-CSF(Abcam)和IL-4(Kingfisher)各50ng/ml。抗体：抗鸡FITC-MHCII(Abcam)、鼠抗鸡CD40和CD86(AbD serotec)、PE标记羊抗鼠二抗(Mul-tiscience)2周SPF鸡购自江南家禽育种有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鸡骨髓DCs的培养 依照文献进行适当改进[3]，首先无菌剥离2周SPF鸡的股骨和胫骨，将骨髓用RPMI1640培养基冲出，离心收集细胞，应用密度梯度离心法(Histopaque-1119,1.119g/ml, 25℃;Sigma)纯化目的细胞。随后，应用完全培养液重悬细胞并铺板，放置37℃，5% CO2培养箱。每隔两天(第2天和第4天)半量换液，第7天收集悬浮细胞并进行形态学观察鉴定。

1.2.2 鸡DCs表型测定 黄曲霉素B1(10ng/ml)与DCs作用24h后，收集细胞，分别应用FITC-MHCII直接免疫荧光染色、CD40和CD86间接免疫荧光染色，最后洗涤细胞3次后，转入流式专用管，应用流式细胞仪进行上机检测。

2 结果与分析

2.1 鸡DCs形态学鉴定

骨髓前体细胞经过7天的细胞因子诱导培养，逐渐由体型较小圆形细胞分化为较大的并具有典型树突样结构的细胞(图1)，以上为鸡DCs的典型形态学特征。

图1 鸡DCs形态学特性鉴定（注：DCs树突(箭头)）

2.2 鸡DCs表型变化

由图2所示，黄曲霉素B1刺激DCs 24 h后，与对照组(Mediun)相比，CD40和CD86的表达显著上调(P<0.05)，而MHCII的表达显著下调(P<0.05)，表明黄曲霉素B1促进DCs不完全成熟。

图2 鸡DCs表型标志变化（注：*表示组间差异显著(P<0.05)）

3 讨论

家禽从饲料中摄入的黄曲霉素B1水平一般处于较低浓度，并不致死。但严重影响家禽的生产性能和免疫接种效力。当疫苗接种后，DCs作为重要的抗原递呈细胞，摄取抗原并快速功能成熟和活化，并向附近引流淋巴结迁移，向淋巴细胞递呈抗原，最终启动获得性免疫应答[2]。因此，DCs功能成熟程度是关键。在成功诱导培养具有典型特征鸡DCs的基础上，评价了B1对DCs功能成熟的影响。结果表明DCs仅能上调CD40和CD86，而不能上调MHCII分子。MHCII是DCs将抗原递呈给T细胞的第一信号，CD40和CD86是第二接头信号，根据免疫学原理，只有双信号均能有效启动，DCs才能完成抗原的递呈[4]。因此本研究结果最终表明B1受损了DCs的抗原递呈功能。张鑫雷等[5]发现B1受损鸡DCs对T细胞增殖能力也验证了以上结论。

[1] 冯建蕾. 黄曲霉毒素的危害和防治[J]. 中国畜牧兽医. 2005(12).

[2] Chang SY, Ko HJ, Kweon MN. Mucosal dendritic cells shape mucosal immunity. Experimental & molecular medicine. 2014;46:e84.

[3] 李冉, 王桂军, 王汉清等. 鸡骨髓源树突状细胞的诱导分化及鉴定[J]. 中国预防兽医学报. 2011(09).

[4] 冯钟煦, 刘剑勇. 树突状细胞的研究进展[J]. 医学综述. 2012(20).

[5] 张鑫雷, 应志豪.。黄曲霉素B1对鸡骨髓源树突状细胞抗原递呈能力的影响[J]. 现代农业科技. 2015(3).

（2016–06–23）

S852.69

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1007-1733(2016)09-0024-02