生物固定化技术及其在染料废水脱色中的应用

张淼，崔岱宗，张昊，何如宝，赵敏

（东北林业大学，黑龙江哈尔滨150036）

生物固定化技术及其在染料废水脱色中的应用

张淼，崔岱宗，张昊，何如宝，赵敏

（东北林业大学，黑龙江哈尔滨150036）

在染料废水的生物处理法中，固定化技术得到了广泛的应用。根据造价及其稳定性，不同的固定化技术适用于不同的染料降解反应中。较游离态而言，生物固定化技术具有高稳定性、高生物活性和重复利用性。最近，关于固定化技术的报道已经有很多。然而，大多数研究均针对于特定的固定化技术的应用。综述了菌体与酶固定化的主要方法，比较了不同固定化技术的优缺点及不同载体材料特性，简述了固定化技术在处理染料废水中的应用。

固定化技术；载体材料；染料废水；脱色

近年来，合成染料广泛应用于工业生产的各个领域〔1〕。目前全球已有十万种不同种类的合成染料，其生产量高达7×107t。在自然条件下，染料降解十分缓慢。此外，染料还具有高致毒性、致突变性和致癌性，严重威胁着人类健康。因此对染料废水的处理迫在眉睫。

传统的废水处理方法包括物化法和生物法。物化法虽然能够使染料废水脱色，但受到各种因素限制〔2〕。与物化法相比，生物法是一种低成本、高效率、环境友好型的处理方法，其利用微生物体内的多种酶系共同作用，不仅能破坏染料的发色团使其脱色，还可以破坏染料的分子结构，将其复杂的化学结构转变成无毒害的小分子，从而达到降解染料的目的〔3〕。

随着生物法的广泛应用，其不足也逐渐显现。在实际生产中，游离细胞或酶会在反应器运行时随流动相大量流失，导致降解效率降低，生产成本增加。研究表明，生物固定化技术能够解决这一问题。其可提高生物质浓度，增强反应稳定性，确保生物活性。固定化的细胞或酶可更好地适应不同理化环境及减轻有毒物质的毒害性，有助于反应的连续性和可操控性。此外，固定化细胞或酶更容易进行固液分离，因此更适用于污水处理系统中。

笔者就生物固定方法、载体材料的研究及其应用现状做了综述，总结了生物固定化技术的方法、载体材料的特性及在染料废水中的应用前景，展望了生物载体材料的发展方向。

1 生物固定化的分类

1.1 酶固定化

1953年，Grubhofer和Schleith率先采用重氮化法将多种酶固定在聚氨基苯乙烯树脂上，制成固定化酶。1969年，固定化酶第一次应用于工业生产。从

此固定化酶技术得到广泛的推广〔4〕，大大提高了酶的重复利用率。

1.2 细胞固定化

微生物能够被吸附到固体支持物上。其在固定化态时具有高生物催化活性、细胞长期稳定性、生物催化再生性以及低扩散性等优点。

2 生物固定化的方法

2.1 化学固定法

2.1.1 共价结合法

共价结合是指生物分子带有的功能基团与载体的活化基团通过共价键方式稳定地结合。在实际生产中避免了酶脱离载体现象的发生，具有很高的热稳定性和可重复利用性，是目前酶固定化研究中最为活跃的领域。但这种紧密的结合严重地限制了酶的自由移动，影响了酶与反应底物的自由结合，从而降低了酶的活性〔5〕。

2.1.2 交联法

交联法是指酶分子之间通过多功能试剂使分子内形成交联从而聚合成一个三级结构或多级结构。常用的交联剂是戊二醛。该方法操作简单，但固定化效率低、机械性能差、稳定性低。

2.2 物理固定

2.2.1 吸附法

吸附结合是指酶或细胞通过吸附被固定在某种载体上的方法，包括物理吸附和离子吸附。其载体有多种材料，如：有机高分子、矿物质盐、金属氧化物等。该法具有易操作、低成本、高活性的优势，在工业生产中普遍使用。但这种酶或细胞与载体结合是最微弱的，容易受周围环境影响，使酶或细胞与载体脱离。

2.2.2 包埋法

包埋法是指具有半渗透性的渗透膜将酶或细胞物理性包埋在其网格或微囊内的方法。该方法可以实现不同酶或细胞的共包埋。此外，包埋法是以生物分子诱捕作为基础，这种技术允许小分子物质通过，因而更适用于酶的固定化技术。

表1是对以上几种固定化技术的比较。

表1 几种固定化技术特性的比较

3 gysc201611固定化常用的传统载体

固定化载体材料需要满足以下要求：（1）机械性能好，化学性能稳定；（2）在下游过程中，被固定的细胞与载体媒介的易分离性；（3）能够保证固定化细胞或酶的活性。载体材料主要分为两大类：天然聚合物和合成聚合物。

3.1 合成聚合物

3.1.1 聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂N，N-亚甲基二丙烯酰胺在催化剂作用下聚合形成的三维网状结构的凝胶。常用的催化剂是过硫酸铵，引发剂是四甲基乙二胺或三乙醇胺。聚丙烯酰胺包埋的优点是机械强度高，化学性能稳定，抗微生物分解性强。但在包埋过程中细胞会受到化学试剂毒害，从而导致酶活降低。由于聚丙烯酰胺本身具有细胞毒性和环境毒性，因而严重影响其在实际生产中的应用。目前，已有对聚丙烯酰胺固定方法进行改良的研究，如：刘桂萍等〔6〕将低分子的聚丙烯酰胺、甲醛和单体丙烯酰胺添加的质量比改为1∶0.6∶0.6后，合成的聚丙烯酰胺对固定的细胞毒害性大大降低，固定化的细胞活性比经传统聚丙烯酰胺固定化后的细胞活性高出42.4%。

3.1.2 聚乙烯醇

聚乙烯醇（PVA）固定化技术对细胞无毒害、机械性强、稳定性高、恢复性好。在热溶于水的聚乙烯醇水溶液中加入添加剂或在低温（-10℃）下可以发生凝胶化，从而将细胞包埋固定。常用的添加剂为硼酸（H2BO3）。近年来，研究者对PVA-H2BO3包埋固定技术进行了大量的完善工作。大量研究表明，在PVA交联过程中加入海藻酸盐可以增强其成球的能力。K.M.Khoo等〔7〕将溶解的PVA和海藻酸钙混合后加入细胞悬浮液制作凝胶小球，发现海藻酸钙的加入增大了小球的直径且降低了物质传递的阻碍。K.Y.A.Wu等〔8〕将海藻酸钠的质量浓度控制在4 g/L下，可以阻止PVA小球形成的黏附问题。

3.2 天然聚合物

与合成聚合物相比，天然聚合物能够提高固定化后的细胞或酶的存活率，避免其在干燥后和保存期间快速地失活。

3.2.1 藻朊酸盐

海藻酸是由β（1，4）-D-甘露糖醛酸和α（1，4）-L-古罗糖醛酸组成的线性聚合物单体。根据这两种酸的性能，海藻酸盐可以在内部形成不同孔径的凝

胶小球。当海藻酸与Ca2+接触时，Ca2+会与线性的聚古罗糖醛酸结合形成交联的网状结构。由于古罗糖醛酸与Ca2+的结合能力要远远高于甘露糖醛酸对Ca2+的结合能力，所以古罗糖醛酸含量越高，凝胶形成就越好。在典型的包埋制作中，海藻酸盐的质量浓度一般控制在10~80 g/L。

曾胤新〔9〕将5m L的Kluyveromyces sp.r-85细胞加到20mL的20 g/L海藻酸钠溶液中，再将之滴入到40 g/L的CaCl2溶液中，最终得到了直径约为2mm的小球。该方法操作简单，所制小球机械性能好。

3.2.2 к-角叉菜胶

к-角叉菜胶是由α（1，4）-D半乳糖和β（1，3）-D半乳糖交替组成基本骨架。其作为螯合剂较海藻酸盐敏感性低，然而，к-角叉菜胶比较脆弱，容易引起固定材料的破裂。在传统操作中，经常使用槐树豆胶增强角叉菜胶的强度。此外，高含量的钾离子也可以提高其强度。

表2是对上述几种载体材料特性的比较。

表2 传统载体材料特性的比较

4 新型载体材料

4.1 纳米材料载体

近年来，纳米材料广泛应用于酶固定化技术。较传统载体，纳米载体具有明显优势：颗粒直径微小、比表面积较大、易于在其表面偶联一些特异性的配体，进而调控酶的结构和特性。此外，纳米材料具有更高的表面自由能，易于分离，提高了生物相容性等独特的优势〔10〕。

4.2 纤维素材料载体

纤维素是一种天然生物降解材料，具有良好的生物相容性和亲水性。作为载体，其具有较强的机械性。R.O.Cristóvão等〔11〕将绿椰纤维素用3-丙基三甲氧基硅烷硅烷化后将漆酶固定其上。被固定的漆酶可以高效对染料废水进行脱色。此外，纤维素单宁树脂载体，多孔醋酸纤维素载体都是较新型的固定化载体〔12〕。

4.3 磁性材料载体

磁性高分子微球是指因内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末而具有磁响应性的高分子微球。其中，Fe3O4是使用比较广泛的金属氧化物。Lincheng Zhou等〔13〕在厌氧条件下将FeCl3和FeCl2溶解后，滴到NaOH溶液中，从而得到Fe3O4纳米物质。这类纯磁性载体分离效果良好，但是对酶的亲和性不高，降低了酶负载量，基于此，他们将Fe3O4与聚氨酯泡沫体（PUF）结合共同包埋细胞用于甲苯的降解。Fe3O4-PUF提高了非亲水性的Fe3O4的热稳定性，这种复合型的磁性材料具有较好的顺磁性，可以通过外部磁场来调控其磁性化和控制其性能。

4.4 介孔材料载体

介孔材料孔径大小可以调控，孔径连通性能好，可为不同大小的酶提供适合的介孔载体。此外，该类型载体还可以促进基底与物质的接触。目前，大孔径、高比表面和孔容的新型介孔材料不断被引入酶固定化领域。近年来，无机-有机复杂介孔材料得到了重视，如：介孔氧化硅、介孔聚合物和介孔金属有机物质。有机物质的加入可以提高载酶量，提高酶的稳定性，增强酶的物理吸附。

5 固定化技术在染料废水脱色中的应用

5.1 偶氮染料

5.1.1 酶固定化技术用于处理偶氮染料废水

M.Chhabra等〔14〕在降解偶氮染料酸性红27的研究中，采用PVA-硝酸盐共价交联的方式固定化漆酶，该方法能够保证漆酶90%的活性，且在4℃的条件下保存5个月后，漆酶的活性仍高于70%，说明固定化漆酶具有较好的稳定性。采用固定化体系对染料进行连续降解，发现在10~20个循环中，脱色率仍保持在90%~95%。S.V.Mohan等〔15〕比较了辣根过氧化物酶分别在游离态和聚丙烯酰胺包埋下对酸性黑10BX的降解能力。结果表明，较游离态而言，聚丙烯酰胺凝胶包埋后的HRP具有较好的降解效果，明显缩短了染料的降解时间。

5.1.2 细胞固定化技术用于处理偶氮染料废水

目前，多种细胞固定化技术已成功地应用于偶氮废水的连续处理中。A.Moutaouakkil等〔16〕在甲基红脱色的研究中，分别采用海藻酸钙、聚丙烯酰胺、蛭石和库伯山毛榉固定化Enterobacteragglomerans。相比之下，海藻酸钙固定化的小球表现出最优的脱色率。在连续脱色的研究中，海藻酸钙小球在连续7个循环中，脱色率并没有明显的下降。LeiYu等〔17〕在分别用海藻酸盐、海藻酸盐-TiO2纳米和海藻酸

盐-活性炭固定化Bacillus sp.CICC23870研究中发现，固定化后的菌体可以高效地降解多种偶氮染料。

5.1.3 生物反应器用于处理偶氮染料废水

在工业废水处理中一般采用生物反应器实现对大量偶氮废水的连续降解。C.J.Ogugbue等〔18〕用海藻酸钙将Bacillus firmus固定化后，应用于对染料C.I.Direct red 80的序批式活性污泥法（SBR）处理系统中，该固定化小球表现出高效的染料脱色能力，且在反应器连续运行中固定化小球始终能够保证较高的机械强度。

混合菌群也被应用到了生物反应器降解偶氮染料的实践中，由好氧菌B acillus vallismortis、B.pumilus、B.cereus、B.subtilis、B.megaterium组成的混合菌群通过大理石碎片固定在上流式生物反应器中降解直接红28，研究发现，在0.6mmol/min的曝气率和60mL/h的流速下，固定化的好氧混合菌群具有较高的脱色率〔19〕。

5.2 蒽醌及三苯甲烷染料

M.D.Stanescu等〔20〕将生物酶固定成小球降解两种蒽醌衍生物酸性蓝和溴氨酸。研究发现，固定后的酶具有更高的稳定性，可以适应较为恶劣的环境，且对染料的降解没有干扰作用。D.K.Sharma等〔21〕将Bacillus sp.、Alcaligenes sp.、Aeromonas sp.固定化后，在上流式反应器中探究降解一种三苯甲烷染料酸性蓝15，研究发现，该种三苯甲烷可以被降解成简单的中间代谢产物，降解率可达94%。

5.3 苯及苯的衍生物

染料经脱色后会产生一些难以降解的物质，苯和苯的衍生物就是其代表之一。研究发现，生物固定化技术也可以应用在苯及苯的衍生物的降解。

M.L.Paje等〔22〕采用海藻酸钙固定Rhodococcus sp.形成凝胶小球，并将其固定在含有陶瓷的生物膜上连续处理废水中的苯，固定后的菌体对苯的降解率达到97%，与游离态的菌体相比，固定化没有影响其降解效果。

S.A.Ahmad等〔23〕采用7.5 g/L的吉兰糖胶将Acinetobacter sp.固定后降解苯酚，研究发现游离态的细胞在较高的苯酚浓度下会失去降解活性，而固定化的菌体不但可以在高浓度的苯酚环境下依然保持对其的降解能力，而且降解效果与游离态菌体类似。此外，该固定化材料的机械性能较好，可以保持活性连续进行45个降解循环。

表3例举了固定化技术在染料降解中的应用。

表3 固定化技术在染料废水中的应用

6 总结和展望

固定化技术虽然具有很大的发展潜力，但是很多方面还不够成熟。固定化方法的改良、固定化材料的探索和优良菌种的选育是实现固定化技术大规模应用的重要途径。其中，载体材料的选择对固定化技术的优化十分重要。固定化材料的稳定性、生物负载、造价成本及生物毒性是决定其经济可行性的关键。但由于载体材料造价高、稳定性差，严重限制了固定化技术的推广，使得固定化技术的发展遇到了瓶颈。因此，新型材料的开发至关重要。目前，高分子复合材料、纳米材料、磁性材料因其性能稳定、成本低廉、传递性高的特点逐步成为研究的热点，但依然存在技术上的不足。这些问题的解决有赖于生物、材料及化工的联合研究。随着科研技术的发展和理论的深入及综合知识的运用，这些问题可以逐一攻克，固定化技术在染料废水处理的领域可以得到广泛的应用。

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Biologicalimmobilized techniques and theirapplication to the decolorization of dyeing wastewater

ZhangMiao，CuiDaizong，Zhang Hao，He Rubao，ZhaoMing
（Northeast Forestry University，Harbin 150036，China）

Immobilization techniques have widely been applied to the biological treatment methods for dyeing wastewater.Different immobilization techniques are suitable for different dyeing degradation reaction，according to their project costand stability.Compared to its free form，bio-immobilization techniques have high stability，high biological activity and reusability.Recently，there have been a lot of reports on immobilization techniques，butmost studies areonly aiming at the application ofspecific immobilization techniques.Themainmethods for thalliand enzyme immobilizationsare introduced and summarized，and the advantagesand disadvantages of immobilization techniques，and the characteristics of different carriermaterials compared.In addition，an accounton the application of immobilization techniques to the treatmentofdyeingwastewater ispresented briefly.

immobilization techniques；carriermaterials；dyeingwastewater；decolorization

X703.1

A

1005-829X（2016）11-0016-05

张淼（1989—），硕士。电话：18646213825，E-mail：540162649@qq.com。通讯作者：赵敏，博士生导师，教授。电话：13104510480，E-mail：82191513@163.com。

2016-09-21（修改稿）

国家自然科学基金（J1210053）；中央高校基本科研业务费（2572015BA04）