榆干离褶伞溶栓酶对血栓模型大鼠血小板活性的影响

刘 雪,王玉娇,全吉淑,沈明花

(延边大学医学院,吉林延吉 133000)



榆干离褶伞溶栓酶对血栓模型大鼠血小板活性的影响

刘 雪,王玉娇,全吉淑,沈明花

(延边大学医学院,吉林延吉 133000)

目的:研究榆干离褶伞(Lyophyllumulmarium,L.u)溶栓酶的抗血栓作用及对血小板活性的影响。方法:三氯化铁诱导大鼠颈动脉血栓模型,检测血栓重量,用流式细胞仪检测CD62P的表达,酶联免疫吸附法测定p-选择素、血管性血友病因子(vWF)、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列腺素E1α(6-keto-PGE1α)的水平。结果:与模型组相比,L.u溶栓酶处理以后大鼠血栓重量明显减轻,CD62P阳性率、p-选择素、vWF、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa以及TXB2的含量不同程度地下降,对6-keto-PGE1α的影响不明显。结论:L.u溶栓酶具有抗血栓作用,其机制可能与抑制血小板的活化作用有关。

榆干离褶伞,溶栓酶,血栓,血小板

榆干离褶伞(Lyophyllumulmarium,L.u),又名榆生离褶伞、大榆蘑,主要分布于我国东北三省。目前,有关榆干离褶伞生物活性方面的研究报道较少。在前期研究中,我们发现榆干离褶伞发酵液具有溶栓[1]、保肝[2]、抗氧化作用[3]和保护血管内皮细胞[4]等功效。我们已从榆干离褶伞菌丝体中分离纯化了分子量为50 ku的溶栓酶,并进行了酶学特性分析[5]。

血栓是血液中纤维蛋白多聚体与细胞组成的复合物,其形成与诸多因素有关。如血管内膜的损伤、血小板的活化、血液粘度的改变等。其中,血小板的粘附、聚集及释放功能的异常是血栓形成过程中的重要因素。在前期工作中,我们发现榆干离褶伞溶栓酶对氧化应激损伤血管内皮细胞具有保护作用[6]。本文中通过建立大鼠颈动脉血栓模型,探讨榆干离褶伞溶栓酶对血小板活性的影响,为阐明其抗栓机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

榆干离褶伞溶栓酶 由延边大学医学院生物化学与分子生物学研究室提供;动物 清洁级SD大鼠40只,体重在180～220 g,雌雄各半,由延边大学动物实验中心提供,实验动物合格证号为SCXK(吉)2011-0007;CD61-PE、CD62P-FITC 购于美国BD公司;p-selectin、vWF、GPⅡb/Ⅲa、6-keto-PGE1α和TXB2试剂盒 均购自上海严谨生物科技有限公司。

流式细胞仪 Beckman公司;MS105DU分析天平 梅特勒公司;5308型全自动离心机 Sigma公司;RT-2100型酶标仪 深圳雷杜公司。

图1 L.u溶栓酶对血小板CD62P表达的影响Fig.1 Effects of fibrinolytic enzyme from L.u on the expression of CD62p of plateletA:假手术组;B:模型组;C:低剂量组;C:中剂量组;D:高剂量组。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及处理 将40只大鼠随机分为5组,即假手术组、模型组、低、中、高剂量用药组。用药组按5、10、40 mg/100 g体质量标准灌胃榆干离褶伞溶栓酶,假手术组和模型组灌胃等量生理盐水,每日1次,连续7 d。末次给药30 min后参照Kurz[7]法复制颈总动脉血栓模型。钝性分离右侧颈总动脉,其底下垫1.5 cm×2 cm的医用敷料,除假手术组外的其余各组用浸有20% FeCl3溶液的滤纸条包裹该段颈总动脉,而假手术组用生理盐替代20% FeCl3溶液。15 min后取下滤纸条,40 min后结扎敷料两端血管,按照敷料长度精确剪下滤纸条包裹的血管,并取出血栓,称重。大鼠心脏取血,全血用于测定血小板CD62P水平,部分血液用枸橼酸钠抗凝,制备血浆,用于血浆指标的检测。

1.2.2 血小板活化CD61/CD62P检测 在流式专用上样管中分别加入CD61-PE、CD62P-FITC抗体2 μL,再加入全血5 μL。避光静置15～20 min,加入预冷的1%多聚甲醛1 mL,4 ℃暗处静置30 min后在流式细胞仪上检测。

1.2.3 血浆指标测定 用ELISA法检测p-选择素、vWF、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、TXB2和6-keto-PGE1α的水平。检测方法按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 统计学处理 数据以均数±标准差表示,用SPSS统计软件处理,组间差异性检验采用单因素方差分析和t-检验。p<0.05差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 榆干离褶伞溶栓酶对血栓重量的影响

表1所示,假手术组无血栓形成,而模型组血栓重量均值为3.2 mg,说明模型组造模成功。与模型组相比,榆干离褶伞溶栓酶中、高剂量给药组的血栓重量明显减轻,具有显著性差异(p<0.05),提示榆干离褶伞溶栓酶具有抗血栓作用。

表1 榆干离褶伞溶栓酶对血栓重量的影响(±s)

注:与模型组相比,*表示p<0.05;“-”表示未进行榆干离褶伞溶栓酶处理或无血栓形成。

2.2 L.u溶栓酶对血小板CD62P的影响

图1为血小板CD61/CD62P散点图。CD62P作为血小板活化的灵敏指标,可反映血小板活化程度。各组血小板CD62P的表达率分别为假手术组(A)为2.67%,模型组(B)为6.64%,低剂量组为4.44%,中剂量组为3.73%,高剂量组的3.53%。与模型组相比,用药组的CD62P的阳性率下降(p<0.05),这就说明榆干离褶伞溶栓酶降低FeCl3诱导的血小板的活化水平。

2.3 L.u溶栓酶对大鼠血浆相关指标的影响

表2 L.u溶栓酶对p-选择素、vWF、GPⅡb/Ⅲa、TXB2和6-keto-PGE1α的影响(±s)

注:与模型组相比,*表示p<0.05;**表示p<0.01;“-”表示未进行榆干离褶伞溶栓酶处理。

表2显示,除了模型组的6-keto-PGE1α水平低于假手术组(p<0.01)以外,p-选择素、vWF、GPⅡb/Ⅲa和TXB2水平明显高于假手术组,这就提示三氯化铁作用于血管以后损伤血管内皮,进一步激活血小板的粘附、聚集功能。与模型组相比,中、高剂量用药组的p-选择素、vWF、Ⅱb/Ⅲa和TXB2水平不同程度地下降,这就说明榆干离褶伞溶栓酶抑制血小板的粘附及聚集。

3 讨论与结论

Lockyer等[8]学者发现,FeCl3溶液外敷使血管内皮细胞损伤,胶原暴露,血小板黏附集聚而形成混合型血栓。动脉外膜上的FeCl3通过胞吞-胞吐作用进入血管腔,通过高铁离子的氧化作用引起血管内皮损伤,继而发生血小板的粘附、聚集和释放反应而形成血栓。本实验以FeCl3溶液外敷颈动脉的方法建立大鼠颈动脉血栓模型,观察了榆干离褶伞溶栓酶的抗栓、抗血小板聚集作用。

实验结果显示,用药组的血栓重量低于模型组,说明榆干离褶伞溶栓酶具有抗血栓作用。诸多研究结果表明,在血栓形成过程中血小板的活化起重要作用。CD62P作为血小板活化的特异性标志物[9],主要分布于血小板的α颗粒和内皮细胞Weibel-palade小体膜上。在某些诱因的作用下,当血小板活化时,血小板表面CD62P表达增多。本实验中模型组的CD62P阳性率明显高于假手术组,说明FeCl3损伤内皮结构和功能,使胶原暴露,促进血小板的粘附和聚集。与模型组相比,用药组CD62P表达减少,并有一定的剂量效果。结果提示,榆干离褶伞溶栓酶有可能直接抑制血小板的活化,或者通过保护血管内皮的作用来间接抑制血小板的粘附、聚集。CD62P又称P-选择素。本实验中采用流式细胞术测定血小板膜CD62P阳性率的同时,测定了血浆P-选择素的含量。结果表明,各组的血浆P-选择素含量变化与血小板CD62P表达趋势相一致,这就进一步验证了榆干离褶伞的抗血小板作用。

本实验中,FeCl3对血管内膜的氧化损伤导致血浆vWF 含量增多,6-keto-PGE1α水平下降。高水平的vWF介导血小板的聚集和释放反应,促进血栓素的合成,故血浆中的TXA2代谢产物-TXB2水平随之增高。这就可以解释模型组的vWF和TXB2水平高于假手术组的现象。vWF水平可以反映内皮受损程度,血浆vWF水平升高可增加血栓形成的危险性[10]。用药组的vWF和TXB2水平明显下降,说明榆干离褶伞溶栓酶一方面通过保护血管内皮细胞,减轻高价铁对血管内皮的损伤,从而降低血浆vWF水平,减轻血小板的聚集从而抑制血栓的形成。另一方面,榆干离褶伞通过抑制血小板的活化,抑制磷脂酶A2的活性,阻断花生四烯酸的代谢,从而减少TXA2的合成。

GPⅡb/Ⅲa作为血栓形成最后途径的关键因子,与纤维蛋白、vWF等配体结合,在血小板聚集和血栓形成中起着重要的作用。血小板活化时,其表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa含量升高并发生构象变化而暴露纤维蛋白原的结合位点,通过纤维蛋白原的桥梁作用使血小板聚集,最终形成血栓[11]。本实验中模型组的GPⅡb/Ⅲa水平显著升高,而用药组其含量减少,提示榆干离褶伞溶栓酶通过抑制血小板GPⅡb/Ⅲa的表达而减轻血小板的聚集,从而减少血栓形成的。

综上所述,榆干离褶伞溶栓酶具有抗血栓作用,对血小板的的抑制作用有可能是抗栓作用的机制之一。

[1]沈明花,彭瀛,宋晓琳. 榆干离褶伞发酵液的溶栓作用与降血脂作用研究[J]. 食品与发酵工业,2011,37(10):28-30.

[2]金梅花,沈玉秀,沈明花. 榆干离褶伞发酵液对急性肝损伤的保护作用[J]. 食品科技,2010,35(4):77-80.

[3]孙权,沈玉秀,沈明花. 榆干离褶伞发酵液体外抗氧化性能研究[J]. 食品科技,2010,35(1):223-225.

[4]彭灜,周广亮,沈明花. 榆干离褶伞发酵液对血管内皮细胞的保护作用[J].食品与生物技术学报,2014,33(2):177-180.

[5] 沈明花,金成俊. 榆干离褶伞溶栓酶的纯化及酶学性质研究[J]. 食品与发酵工业,2007,33(8):45-47.

[6]周广亮,丛贺,全吉淑,等. 榆干离褶伞溶栓酶对氧化应激损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用[J].食品科学,2016,37(1):171-175.

[7]Kurz KD,Main BW,Sandusky GE. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride[J]. Thromb Res,1990,60(4):269-280.

[8]Lockyer S,Kambayashi J. Demonstration of flow and platelet dependency in a

ferric chloride-induced model of thrombosis[J]. J Cardiovasc Pharmacol,1999,33(5):718-725.

[9]王新华,邸彦辉.熟蒜黄汁抗血小板聚集功能机制研究[J]. 中国实验血液学杂志,2014,22(3):753-757.

[10]Takahashi M,Yamashita A,Moriguchi-Goto S,et al. Critical role of von Willebrand factor and platelet interaction in venous thromboembolism[J].Histol Histopathol,2009,24(11):1391-1398.

[11]Gachet C. Regulation of platelet functions by P2 receptors[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol,2006,46:277-300.

Effect of fibrinolytic enzyme fromLyophyllumulmariumon platelet activation in thrombotic rat

LIU Xue,WANG Yu-jiao,QUAN Ji-shu,SHEN Ming-hua*

(Medical College Yanbian University,Yanji 133000,China)

Objective:To study the antithrombotic effect and the effect on platelet activity of fibrinolytic enzyme fromLyophyllumulmarium. Methods:The carotid arterial thrombosis model was induced by ferric chloride in rats,and then the thrombus weight was detected. The expression of CD62p on the platelet were applied by flow cytometric analysis,and the levels of p-selectin,vWF,platelet glycoprotein Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa),TXB2and 6-keto-PGE1α,in plasma were measured. Results:Compared with the model group,fibrinolytic enzyme fromLyophyllumulmariumreduced thrombus weight,suppressed the expression of CD62p,and reduced the contents of P-selectin,vWF,platelet glycoprotein GPⅡb/Ⅲa and TXB2. However,there was no significant difference in the 6-keto-PGE1αlevel. Conclusion:Fibrinolytic enzyme fromLyophyllumulmariumhas an antithrombotic activity,and the mechanism may be due to inhibition of platelet activity.

Lyophyllumulmarium;fibrinolytic enzyme;thrombus;platelet

2016-03-30

刘雪(1991-)，女，硕士，研究方向：天然物质活性研究，E-mail:928710669@qq.com。

*通讯作者:沈明花(1970-)，女，博士，副教授，研究方向：食用菌生物活性，E-mail:sdjjch@ybu.edu.cn。

国家自然科学基金资助项目(30760150，81360088)。

TS255.3

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000