东祁连山高寒草地几种禾本科牧草根际促生菌研究

李建宏，李雪萍，马文文，姚拓*，孙建军，蒋永梅，张建贵，师尚礼

(1.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070；2.草业生态系统教育部重点实验室，甘肃 兰州 730070；3.临洮县农业技术推广中心，甘肃 临洮 730500)



东祁连山高寒草地几种禾本科牧草根际促生菌研究

李建宏1,2，李雪萍1,2，马文文1,2，姚拓1,2*，孙建军3，蒋永梅1,2，张建贵1,2，师尚礼1,2

(1.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070；2.草业生态系统教育部重点实验室，甘肃 兰州 730070；3.临洮县农业技术推广中心，甘肃 临洮 730500)

本研究以东祁连山高寒草地常见的7种禾本科牧草为材料，通过分离培养的方法研究了其根际细菌的数量和分布，重点研究了其有固氮作用的细菌数量和分布。结果发现，7种植物根际均存在大量的细菌，总数在2.50×106～17.07×106cfu/g，不同植物根际细菌的数量和分布不同，以高原早熟禾根际细菌数量最多，冰草和赖草根际细菌最少，其余禾草居中；根际固氮菌的数量和分布也因牧草种类不同而不同。7种供试植物根际分离到固氮菌201株。且细菌和PGPR菌株的数量均呈现“根系表面(RP)>根际土壤(RS)>根内(HP)”的分布趋势，表现出强烈的根际效应。

禾草；PGPR；联合固氮菌

禾本科牧草是最重要的饲草饲料作物，不论是分布范围、面积，还是经济价值、生态意义，均显示出其他科植物无法比拟的优点。但该科植物对氮需求量较大，氮供应量直接影响其生存状况与功能发挥。为了满足禾本科植物生存、生产所需要的氮素营养，化肥一直被认为是实现这一目的的主要途径，然而在经济落后且土地贫瘠的西北地区，在草地上大量使用高成本化肥在某种程度上说是一种“奢望”。而且随着化肥使用量的增加，土壤和植物中的NO2-积累，大量磷素被固定，导致了肥效下降，肥料利用率降低，环境污染加重，人、畜及食品安全难以保障，土壤结构及微生物多样性的破坏等一系列问题。因此，研究开发对环境友好的新型肥料来替代化肥就是一项十分迫切的任务。

研究表明，植物根际生存着许多对植物生长有益的细菌，它们生活在土壤或定植于植物根表、根内，在其生长代谢过程中能产生许多促进植物生长的物质。这类细菌被称为植物生长促进菌(plant growth promoting rhizobacteria，简称PGPR)。这类菌一般指具有固氮、解磷、产生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中一种能力的细菌、蓝细菌等[1-2]。PGPR是宝贵的生物资源，其发现及分离培养、筛选将为禾本科植物固氮、溶磷、产生植物激素、分泌抗生素的研究及生物菌肥的开发起到巨大的作用。PGPR菌株不仅可以促进植物生长、提高作物产量和质量，还可以改善土壤结构，提高土壤有机质含量，改良盐碱地。如荣良燕等[3]的研究结果显示PGPR菌可以提高岷山红三叶(Trifoliumpratense)的干草产量以及干草中的粗蛋白含量，降低纤维含量，从而提高其产量和质量；刘方春等[4]的研究则证实了PGPR生物肥的施用提高了甜樱桃(Prunusavium)根际土壤中养分离子的有效性和养分保持能力，促进了表层土壤中根系的生长。因此，PGPR资源的开发利用已成为人们关注的焦点[5]。

祁连山位于我国青海省东北部与甘肃省西部边境，是我国主要山脉之一。1988年经国务院批准建立 “祁连山国家级自然保护区”(2015年1月获批国家环保科普基地)。祁连山具有涵养水源、调节气候、保护绿洲、防治荒漠、固持土壤、保护物种和储存基因等重要的生态功能，是国际生物多样性保护的重点区域，也是国家生态安全格局“北方防沙带”中重要的一环，我国草地学家对其资源的开发利用、防止退化及提高草地生产力等方面进行了广泛的研究，取得了多项重要理论和实践成果，并已广泛应用于生产[6]。但对于微生物资源研究较少，尤其是对禾本科牧草联合固氮菌资源状况很少见诸报道。因此，研究和开发该地区促生菌(PGPR)资源，进而开发出适宜于该地区的微生物肥料制品，对于解决该地区天然草地肥料的供给，实现农牧业可持续发展具有重大意义。

为了探索和发掘新的生物资源，本研究从东祁连山高寒草地主要禾本科牧草根际分离筛选促生菌，并对其特性进行研究和评价，为进一步开发利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于甘肃省武威市天祝藏族自治县抓喜秀龙沟甘肃农业大学高山草原试验站(坐标为N 37°11′-37°13′，E 102°29′-102°33′)，海拔为2960～2990 m，气候寒冷潮湿，年均温-0.1 ℃，>0 ℃年积温1380 ℃，水热同期，年平均降水量416 mm，多为地形雨，集中于7-9月，年蒸发量1592 mm。年日照时数2600 h；无绝对无霜期，仅分冷、热两季。植被以早熟禾(Poaspp.)、嵩草(Kobresiabellardii)、苔草(Carexspp.)、针茅(Stipacapillata)、金露梅(Potentillafruticosa)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、棘豆(Oxytropisspp.)、委陵菜(Potentillachinensis)、甘肃马先蒿(Pediculariskansuensis)等为主。土壤以亚高山黑钙土、亚高山草甸土为主，有机质含量10%～16%，水分含量40%～80%，全磷含量0.056%～0.071%，全氮含量0.5%～0.8%，pH为7.0～8.2[7]。

1.2 样品采集与处理

于2015年7月在研究区采集当地较常见的高原早熟禾(Poaalpigena)、垂穗披碱草(Elymusnutans)、醉马草(Achnatheruminebrians)、赖草(Leymussecalinus)、冰草(Agropyroncristatum)、紫花针茅(Stipapurpurea)和糙毛鹅观草(Roegneriahirsuta)7种禾本科植物根际样品(包括植物根系和土壤)，将取得样品装入无菌聚乙烯袋中，低温运输至实验室立即进行PGPR 菌株分离。

分离时为了方便研究细菌在植物根际的分布，将根际分为根际土壤(soil adhering to roots, RS)、根系表面(rhizoplan or surface of roots,RP)与根内(histoplan or interior of roots，HP)3个区域[8]。

1.3 不同植物根际细菌的数量与分布测定

植物根际细菌的数量测定与分离用涂布平板法，培养基选用NA 培养基[9]。称取样品1 g，放入装有9 mL 0.85%无菌生理盐水中，800 r/min震荡2 min，静置20 min后取上清液，然后依次稀释至10-3、10-4、10-5，充分混匀后吸取50 μL接种于NA平板固体培养基上，每个区域的每个梯度稀释液各重复 3 次，用无菌涂布器涂抹均匀，28～30 ℃的培养箱中培养3 d后计数，计算细菌的数量。计算公式如下：

细菌数量(cfu/g)=(菌落平均数×稀释倍数)/干土

NA培养基配方为：蛋白胨 5.0 g，牛肉膏 3.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂 18.0 g，总体积 1000 mL，pH 7.0～7.2。

1.4 联合固氮菌的分离与纯化

在NFM培养基[9]表面运用涂布平板法分离纯化不同植物不同部位的联合固氮菌。分别取已制备的3个区域的10-3、10-4、10-5稀释液50 μL接种于NFM 固体培养基上。每个区域的每个梯度稀释液各重复 3 次，用无菌涂布器均匀涂抹到培养基表面，28 ℃的培养箱中培养3 d后计数，计算固氮菌的数量，计算公式与1.3相同。

NFM培养基配方为：苹果酸 5.0 g，KOH 4.5 g，K2HPO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，NaCl 0.1 g，NaMoO4·2H2O 0.002 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，生物素 10 μg，0.5%溴麝香草酚蓝5 mL，琼脂 2%，总体积 1000 mL，pH 7.0。

1.5 数据分析

用 Microsoft Excel 2007录入数据，用Word 2007进行表格制作。采用DPS 7.65统计分析软件分别对不同植物不同部位总细菌和PGPR的数量进行显著性分析，选用 Duncan法进行多重比较，并就总细菌数量和功能菌(固氮菌或溶磷菌)数量进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同植物根际细菌的数量及分布

采用NA平板计数法测定了7种供试植物根部3个区域细菌的数量及分布，如表1所示，不同植物根际细菌总数和分布不同，同一植物根部不同部位细菌数量也不同，除赖草和冰草之间差异不显著外，其余植物根际细菌分布数量差异显著(P<0.05)，高原早熟禾根际细菌分布数量最多，糙毛鹅观草根际细菌分布数量次之，垂穗披碱草根际细菌分布数量仅次于糙毛鹅观草，醉马草、冰草和赖草根际细菌分布数量较少。除醉马草外，各植物根际3个分布区域细菌的数量都呈现出“根系表面>根际土壤>根内”的分布趋势。

2.2 不同植物根际固氮菌的数量及分布

采用NFM选择性培养基从7种供试植物根际分离到生长速度快、菌落较大的菌株，进一步纯化得到联合固氮菌201株(表2)，其中，分离自醉马草根际的菌株最多，分离自高原早熟禾根际的菌株次之，垂穗披碱草根际分离到的菌株仅次于高原早熟禾，赖草根际分离到的菌株居中，糙毛鹅观草根际分离的菌株较少，冰草根际分离到的菌株最少。

2.3 根际总微生物数量和PGPR数量相关性分析

如表5所示，根系表面和根际土壤所含的细菌数量和土壤细菌总数呈极显著相关，而根内细菌数量和土壤细菌总数呈显著相关或不相关。对于固氮菌而言，细菌总数与根际土壤、根系表面和根内固氮菌的含量都呈极显著相关或显著相关，这预示着无论在根际土壤还是根系表面和根内，都有相当数量的固氮细菌存在。

3 讨论

3.1 不同植物根际PGPR菌株分布规律不同

从7种植物根际分离的细菌、固氮菌的数量和种类有很大差异。这与植物种类本身及其生存的环境(如各植物所处区域土壤肥力、水热状况)有关[10-11]，还与不同的植物根系向土壤中分泌的不同物质有一定关系[12]，此外也与采集样品的时间、保存样品的时间及方式和所用选择性培养基的种类等有关[12-16]。土壤细菌所需营养主要来源于植物残体，不同的植物必然导致细菌在各植物根际分布的不均一性[13]。我们认为每种牧草根系与其周围的固氮微生物是一个统一的生态环境。

表1 不同禾草根际土壤细菌数量及分布Table1 Thenumberanddistributionofbacteriasinrhizospheresoilofdifferentsampleplantscfu/g植物Plants细菌数量Thenumberofbacterias(×106)总数Total根际土壤RS根系表面RP根内HP高原早熟禾P.alpigena17.07a5.679.451.95垂穗披碱草E.nutans10.68c4.555.900.23醉马草A.inebrians4.10d2.551.470.08赖草L.secalinus2.50f0.791.590.12冰草A.cristatum2.53f0.801.520.21紫花针茅S.purpurea3.31e1.411.890.01糙毛鹅观草R.hirsuta13.91b4.708.810.40 注:同列不同字母表示差异显著(P<0.05);RS:根际土壤;RP:根系表面;HP:根内。下同。 Note:DifferentlowercaselettersinthesamecolumnmeansignificantdifferencesatP<0.05level.RS:Soiladheringtoroots;RP:Rhizoplanorsurfaceofroots;HP:Histoplanorinteriorofroots.Thesamebe-low.

表2 不同禾草根际固氮菌株数量及分布Table2 Thenumberanddistributionofnitrogenfixingbacteriainrhizosphereofplants株Strains植物Plants总数Total菌株分布Distribution根际土壤RS根系表面RP根内HP高原早熟禾P.alpigena37a15166垂穗披碱草E.nutans34ab11176醉马草A.inebrians39a16194赖草L.secalinus27c9135冰草A.cristatum14e572紫花针茅S.purpurea30bc12144糙毛鹅观草R.hirsuta20d6113表3 根际总微生物数量和PGPR数量相关性分析Table3 CorrelationanalysisofrhizospheretotalmicroorganismquantityandPGPRnumber项目ItemRS(B)RP(B)HP(B)T(NFB)RS(NFB)RP(NFB)HP(NFB)Total(B)0.97**0.99**0.78*0.250.170.220.43RS(B)0.93**0.680.400.310.410.50RP(B)0.73*0.130.040.110.36HP(B)0.310.350.160.46T(NFB)0.96**0.98**0.78*RS(NFB)0.90**0.63RP(NFB)0.73* *P<0.05;**P<0.01;T:总数Total;B:细菌Bacteria;NFB:固氮菌Nitrogenfixingbacteria.

分离自7种不同植物的总微生物和固氮微生物的数量在植物根际的分布均表现出根系表面(RP)数量最多，根际土壤(RS)仅次于根系表面，根内(HP)的最少，即“根系表面>根际土壤>根内”的分布趋势，这与姚拓等[13-15]、张英[12]的结果大体一致。产生这种结果的原因一方面可能与菌株本身的属性有关，菌株越接近根表，越容易获取植物分泌的某些物质，使得聚集在根表的微生物越多[17];另一方面由于在土壤表层和植物根系表层土壤细菌分布密集，积累的枯枝落叶和根系分泌物也多，可为细菌生长提供丰富的营养[18]；也可能与土壤温度、土壤湿度、土壤中的氧气分布、牧草种类以及C/N有关[19]。

3.2 PGPR菌株分布数量与根际总细菌数量的相关性问题

本研究相关性分析结果显示根表面和根表土所含的细菌数量和土壤细菌总数呈极显著相关，而根内细菌数量和土壤细菌总数呈显著相关或不相关，这一结果预示着植物根际土壤中细菌的主要分布是根表面和根表土壤，也印证了本研究得出的土壤微生物数量“根系表面(RP)>根际土壤(RS)>根内(HP)”的分布规律。

4 小结

不同禾草根际的细菌数量不同，高原早熟禾根际细菌分布数量最多，糙毛鹅观草根际细菌分布数量次之，垂穗披碱草根际细菌分布数量仅次于糙毛鹅观草，醉马草根际细菌分布数量较少，冰草和赖草根际细菌分布数量最少。

7种供试禾草根际共分离到固氮菌201株。细菌和固氮菌株的数量分布呈现“根系表面(RP)>根际土壤(RS)>根内(HP)”的分布趋势，表现出强烈的根际效应。

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The study of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) from several Poaceous species in the East Chi-lien Mountains of China

LI Jian-Hong1,2, LI Xue-Ping1,2, MA Wen-Wen1,2, YAO Tuo1,2*, SUN Jian-Jun3, JIANG Yong-Mei1,2, ZHANG Jian-Gui1,2, SHI Shang-Li1,2

1.CollegeofPrataculture,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,Lanzhou730070,China; 3.LintaoCountyAgriculturalTechnologyPromotionCenter,Lintao730500,China

This research studied the quantity and distribution of bacteria in the rhizosphere of seven Poaceous species from the east Chi-lien Mountains. The research employed a cultivation method, and mainly studied nitrogen fixing bacteria. It was found that there were large numbers of bacteria in rhizospheres of all 7 plant species studied. The total number of rhizosphere bacteria counted ranged from 2.5×106cfu/g to 17.07×106cfu/g, withAgropyroncristatumandLeymussecalinushaving the lowest rhizosphere nitrogen-fixing bacterial populations andPoaalpigenahaving the highest, with the other 4 species intermediate. A total of 201 nitrogen-fixing strains were isolated from the 7 grass species studied. The quantity of bacteria and PGPR present a distribution trend: “root system surface (RP)>root surface soil (RS)>histoplan or interior of roots (HP)”.

grasses; plant growth promoting rhizobacteria (PGPR); Nitrogen fixing bacteria

10.11686/cyxb2016090

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-04；改回日期：2016-06-06

国家自然科学基金项目(31360584)和农业部国家牧草产业技术体系(CARS-35)项目资助。

李建宏(1986-)，男，甘肃临潭人，在读博士。E-mail:lijianhong123@126.com*通信作者Corresponding author. E-mail:yaotuo@gsau.edu.cn

李建宏，李雪萍，马文文，姚拓，孙建军，蒋永梅，张建贵，师尚礼. 东祁连山高寒草地几种禾本科牧草根际促生菌研究. 草业学报, 2016, 25(11): 173-177.

LI Jian-Hong, LI Xue-Ping, MA Wen-Wen, YAO Tuo, SUN Jian-Jun, JIANG Yong-Mei, ZHANG Jian-Gui, SHI Shang-Li. The study of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) from several Poaceous species in the East Chi-lien Mountains of China. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(11): 173-177.