系统性红斑狼疮与肠道菌群的相关研究

李苗 付冰冰 吴霞 胡泽昆 孙晓鹏



·临床研究论著·

系统性红斑狼疮与肠道菌群的相关研究

李苗 付冰冰 吴霞 胡泽昆 孙晓鹏

目的 探讨SLE与肠道菌群、炎症因子及疾病活动度之间的关系，以及经糖皮质激素(激素)联合羟氯喹治疗后三者的变化及其治疗作用机制。方法 选择25名健康体检者(正常对照组)及30例初诊SLE患者(SLE组)，后者接受为期3个月的激素联合羟氯喹治疗，分别收集正常对照组及SLE组患者治疗前后的粪便标本，应用SYBR Green I实时荧光定量PCR对大肠埃希菌、双歧杆菌、乳酸杆菌定量，同时应用ELISA法对外周血中IL-17、转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平进行检测， 并行SLE疾病活动指数(SLEDAI)评价SLE患者的病情活动程度。结果 与正常对照组相比，治疗前SLE患者大肠埃希菌数较多(P<0.01)，双歧杆菌、乳酸杆菌数较少(P均<0.01)；外周血中IL-17水平较高(P<0.05)，且与SLEDAI评分呈正相关(r=0.699，P<0.05)；TGF-β水平下降(P<0.05)，且与乳酸杆菌的数量呈正相关(r=0.416，P<0.05)。与治疗前相比，激素联合羟氯喹治疗3个月后 SLE患者粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌数减少(P均<0.05)，大肠埃希菌数无明显变化(P>0.05)；SLE患者SLEDAI评分降低(P<0.05)，血清IL-17水平下降(P<0.01)、但仍高于正常对照组(P<0.01)，TGF-β水平升高(P<0.01)、但仍低于正常对照组(P<0.05)。结论 SLE患者存在较明显的肠道菌群失调状态。激素联合羟氯喹治疗可改善SLE患者的病情，但同时可能会进一步加重肠道菌群失调状态。IL-17及TGF-β等炎症因子可能参与SLE的发病及治疗作用机制。SLE状态下，乳酸杆菌与TGF-β可能有关。

系统性红斑狼疮； 肠道菌群；糖皮质激素；羟氯喹；实时荧光定量聚合酶链式反应

Glucocorticoid; Hydroxychloroquine; Real-time PCR

SLE是一种累及全身多系统多脏器的自身免疫性疾病，发病机制目前尚未明确，一直是当前风湿病领域研究的热点问题[1-3]。辅助性T细胞17(Th17)和调节性T细胞(Treg)及其下游表达的相关炎症细胞因子IL-17、转化生长因子-β(TGF-β)在SLE发病过程中尤为重要[4]。肠道黏膜免疫反应是机体免疫系统的重要组成部分，其主要依靠黏膜内T、B细胞及分泌至肠腔中的sIgA等共同完成局部免疫功能[5]。肠道菌群作为黏膜免疫重要参与者，通过影响黏膜免疫中特定的炎症因子发挥对机体免疫系统的整体调节作用。糖皮质激素(激素)及免疫抑制剂是目前治疗SLE的一线药物，可有效改善SLE患者的病情。本研究采用自身对照的实验设计，应用SYBR Green I荧光定量PCR及ELISA对SLE患者在治疗前后的肠道菌群及外周血炎症因子进行定量，旨在分析在疾病状态下及治疗后各研究指标的差异，阐明肠道菌群与IL-17、TGF-β等炎症细胞因子在SLE的发病机制、疾病进展及治疗中的作用。

对象与方法

一、研究对象

选取2014年1月至2014年12月佳木斯大学附属第一医院风湿免疫科门诊及住院部初诊SLE患者30例为SLE组，纳入标准：①年龄18～55岁；②符合美国风湿病学会1982年诊断标准，确诊为SLE。排除标准：①近4周内曾应用抗生素或微生物制剂；②近期有肠道手术史；③药物依从性差及不配合患者。其中男2例、女28例，年龄19～54岁、中位年龄26岁。另选择同期在我院行健康体检的25名健康人为正常对照组，该25人与30例SLE患者的性别构成、年龄比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。本研究的各个程序均符合医院伦理委员会所制定的伦理学标准，所有入组者均签署知情同意书。

二、治疗方法

所选取的初诊患者均根据2010年中华医学会SLE诊断及治疗指南规范治疗：联合使用激素和羟氯喹，剂量为泼尼松0.5～1 mg/(kg·d),或甲泼尼龙40～60 mg/d，持续应用1周，之后依据患者病情调整剂量，同时使用羟氯喹0.2～0.4 g/d。

三、检测方法

1. 主要试剂及仪器

主要试剂包括日本Takara 2倍浓缩的实时定量PCR扩增的预混和溶液，Taq DNA 聚合酶，普通PCR产物纯化试剂盒，粪便基因组DNA提取试剂盒。主要仪器有美国Bio-Rad核酸蛋白检测仪，德国Biometra温度梯度PCR仪，北京六一电脑三恒多用电泳仪，上海领成Tocan凝胶成像分析仪，美国ABI 7300实时荧光定量PCR仪。

2. 粪便标本采集及检测

分别收集正常对照组和SLE组患者在治疗前及治疗3个月的粪便标本，40 min内保存于-80℃冰箱。称取中段200 mg便样，严格按照粪便基因组DNA提取试剂盒操作说明操作，对所提取DNA进行浓度及纯度检测，OD260/OD280均在1.8～2.0，多管分装并置于-20℃冰箱冻存备用。取上述提取DNA产物应用SYBR Green I 实时荧光定量PCR法对粪便标本中的大肠埃希菌、双歧杆菌及乳酸杆菌定量。根据参考文献[6]设计引物序列，由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列信息见表1，进行常规PCR反应。PCR反应体系为25 μl：上、下游引物各1 μl，5 U/L Taq聚合酶0.2 μl，模板DNA 2 μl，MgCl24 μl， 重蒸水16.8 μl。反应条件：95℃预变性5 min，95℃15 s，退火30 s(大肠埃希菌60℃、双歧杆菌52℃、乳酸杆菌54℃)，72℃延伸45 s，共35个循环，最后72℃复性10 min。反应结束后将PCR产物置于1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，时间50 min。琼脂糖凝胶电泳结束以后，应用Tocan凝胶成像分析系统对各电泳条带进行摄像。另外，将普通PCR产物进行切胶回收，严格按照普通PCR产物纯化回收试剂盒操作说明对PCR产物进行纯化回收，将回收后的产物用紫外分光光度计测定其浓度和A值，换算成各标准品1 μl的拷贝数。将各标准品做10倍系列梯度稀释，设置5个浓度梯度点，进行荧光定量PCR，反应体系20 μl：2倍浓缩的实时定量PCR扩增的预混和溶液 10 μl、上、下游引物25 mmol/L各0.8 μl、ROX 0.4 μl，标准品DNA模板1.5 μl，重蒸水6.5 μl。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环，最后95℃复性15 s。根据实验结果生成标准曲线。反应结束后将产物从60～95℃以0.5℃间隔逐渐加热，绘制熔解标准曲线图。通过标准曲线计算得到各待测样品中大肠埃希菌、双歧杆菌、乳酸杆菌的拷贝数。

表1 各肠道菌群16SrDNA引物序列

3. 血清IL-17和TGF-β水平检测

分别于正常对照组入组时和SLE组患者治疗前及治疗3个月的清晨采集其外周肘静脉血，低速离心分离血清，采用ELISA法检测正常对照组及SLE患者治疗前、后血清中IL-17、TGF-β水平，严格按照试剂盒说明书操作。

四、临床资料的采集及SLE疾病活动指数(SLEDAI)评分

分别于治疗前、治疗3个月，对SLE组患者进行病史采集、体格检查及实验室相关指标检测，并进行SLEDAI评分，了解患者病情活动情况。

五、统计学处理

结 果

一、引物特异性验证结果

用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR引物的特异性，以500 bp标记物为标尺，从图1中普通PCR产物可见明亮的特异性条带，无引物二聚体等非特异性扩增，说明引物特异性好。

二、扩增曲线

实时荧光定量PCR反应，以循环数为横坐标，实时荧光强度为纵坐标，两者形成S型扩增曲线，荧光强度随模板循环数的增加而增加，经过指数扩增期、线性扩增期之后到达平台期，各肠道菌群的扩增曲线见图2。

图1 引物特异性验证结果

M：标记物；1：大肠埃希菌(190 bp)；2：乳酸杆菌(232 bp)；3：双歧杆菌(198 bp)

三、标准曲线

以各标准品的拷贝数的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标，由软件自动绘制出各标准菌的标准曲线，拷贝数与Ct值之间的线性关系可以计算出待测样本中各个细菌的拷贝数。大肠埃希菌属：Y=-3.603X+42.377，r= 0.999；双歧杆菌属：Y=-8.846X+46.678，r= 0.999；乳酸杆菌属：Y=-3.310X+36.446，r=0.998；r值均大于0.990，见图3。

图2 SLE患者粪便标本的肠道菌群扩增曲线

A：大肠埃希菌扩增曲线；B：双歧杆菌扩增曲线；C：乳酸杆菌扩增曲线

图3 SLE患者粪便标本的肠道菌群标准曲线

A：大肠埃希菌标准曲线；B：双歧杆菌标准曲线；C：乳酸杆菌标准曲线

四、熔解曲线

SYBR Green染料是一种非特异的染料，可嵌合于双链DNA的小沟，只有双链DNA才会发出荧光，在延伸结束阶段采集荧光信号，熔解曲线是对PCR引物特异性进一步验证，观察扩增产物是否为所需要目的产物，本研究3种细菌的熔解曲线均为单峰，说明扩增产物为目标产物，且无非特异性扩增，见图4。

图4 SLE患者粪便标本的肠道菌群熔解曲线

A：大肠埃希菌熔解曲线；B：双歧杆菌熔解曲线；C：乳酸杆菌熔解曲线

五、肠道菌群定量结果

采用实时荧光定量PCR分析正常对照组及SLE患者在治疗前后肠道内大肠埃希菌、双歧杆菌以及乳酸杆菌3种细菌数的变化。与正常对照组相比，治疗前SLE患者肠道内大肠埃希菌数较多(P<0.01)；双歧杆菌和乳酸杆菌数较少(P<0.01)。应用激素及羟氯喹治疗后，SLE患者肠道双歧杆菌和乳酸杆菌数比治疗前减少(P均<0.05)，大肠埃希菌数无变化(P>0.05)，见表1、2。

表1 SLE组与正常对照组的3种肠道菌群数量比较 lg copies/g

注：与正常对照组比较，SLE组治疗前t大肠埃希菌=2.552、t双歧杆菌=3.461、t乳酸杆菌=2.322，aP<0.05、bP<0.01；与SLE组治疗前比较，SLE组治疗后t大肠埃希菌=1.540、t双歧杆菌=6.783、t乳酸杆菌=9.264，cP<0.01

六、外周血IL-17、TGF-β水平及SLEDAI评分结果

与正常对照组相比，SLE组患者血清中IL-17水平增高(P<0.05)，且与SLEDAI评分呈正相关(r=0.699，P<0.05)，见图5A；TGF-β水平下降(P<0.05)，且与乳酸杆菌数呈正相关(r=0.416，P<0.05)，见图5B。经激素及羟氯喹治疗后，SLE组患者血清中IL-17水平下降(P<0.01)，但仍高于正常对照组(P<0.01)；TGF-β水平升高(P<0.01)，但仍低于正常对照组(P<0.01)。SLE患者治疗后，SLEDAI评分明显降低(P<0.05)，见表2。

表2 SLE组与正常对照组的外周血IL-17、TGF-β及SLEDAI比较

注：与正常对照组比较，SLE组治疗前tIL-17=10.831、tTGF-β=9.759，SLE组治疗后tIL-17=8.492、tTGF-β=2.461，aP<0.01、bP<0.05；与SLE组治疗前比较，SLE组治疗后tIL-17=6.562、tTGF-β=-9.450、tSLEDAI=4.071，cP<0.01

图5 IL-17与SLEDAI评分及TGF-β与乳酸杆菌数的相关性分析

A：IL-17与SLEDAI的相关性分析；B：TGF-β与乳酸杆菌数的相关性分析

讨 论

IL-17本质是一种含155个氨基酸的糖蛋白，可通过刺激中性粒细胞、单核细胞，诱导趋化因子(如MCP-1)与细胞因子(如IL-6、TNF-α)，促进自身抗体的产生，加重局部炎症和对组织的损伤。多项研究发现，IL-17在新发SLE、儿童SLE、青少年SLE以及发病的孕妇中均呈增高的趋势[7-9]。此外，在SLE患者外周血中Th17水平及在活化的外周血单个核细胞中mRNA的表达也有增加[10]。本研究通过ELISA法检测IL-17水平发现，SLE患者外周血IL-17水平高于正常对照组，且与SLEDAI评分呈正相关，与上述研究结果一致，表明在SLE患者体内IL-17水平呈增高趋势，推测可能为SLE患者体内存在IFN-α- B细胞刺激因子(BLyS)-IL-17轴，通过激活BLyS，促进B细胞的增殖和分化，产生大量自身抗体并促进Th17细胞分泌IL-17，促发机体持续性炎症反应，同时大量自身抗体形成的免疫复合物还可通过浆细胞样树突状细胞(pDCs)促进IFN-α的形成，加重SLE炎症状态[11]。另有研究表明，IL-17与IL-6存在强相关，且IL-17/1L-6更能反映疾病活动程度，IL-17主要由初始CD4+T细胞在IL-6及TGF-β作用下分化的Th17细胞直接分泌，高水平的IL-6可进一步促进IL-17的表达，上调炎症反应[12]。由此可推测，IL-17可通过驱动不同的免疫途径，影响SLE的发病进展，另有研究发现，血清巨噬细胞移动抑制因子水平亦与狼疮疾病活动性有关[13]。

TGF-β家族由一类结构、功能相关的多肽生长因子亚家族组成, TGF-β对巨噬细胞、淋巴细胞等产生免疫抑制功能，对维持机体免疫耐受发挥重要作用[14]。本研究显示，初治SLE患者与正常对照组相比，TGF-β水平下降，与李志等[15]研究结果相符。目前已有相关研究证实，SLE患者体内多态性启动因子C-509T可能会增强 SLE的遗传易感性，其可对TGF-β基因产生影响，降低TGF-β的表达[16]。同时当内环境中仅有TGF-β存在时，初始CD4+T细胞分化为Treg，而不会分化为Th17，从而发挥免疫抑制作用，有效抑制免疫活性细胞的增殖和分化，当IL-6大量存在时，抑制Treg细胞的增殖，与TGF-β共同诱导Th17的分化，分泌IL-17介导机体炎症反应。在SLE状态下Th17的过度分化使IL-17、IL-23等促炎细胞因子的过度表达，TGF-β不能发挥原有的免疫抑制功能，从而打破了两者之间正常的免疫平衡状态，导致SLE的发病[17]。

肠道菌群是存在于人体胃肠道内的正常微生物群，不仅参与构成肠道的生物屏障，还可参与人体多种病理生理性代谢过程。本研究显示，与正常对照组相比，SLE患者肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌数明显减少，大肠埃希菌数量明显增多。大肠埃希菌为条件致病菌[18]。当肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌数减少时，其竞争性抑制作用减弱，大肠埃希菌等条件致病菌处于生长优势，因此当SLE患者肠道内有益菌和条件致病菌之间的平衡打破，就会造成肠道菌群失调，机体免疫功能障碍，导致SLE等多种自身免疫性疾病的发生[19-20]。本研究结果显示，乳酸杆菌数与外周血TGF-β水平呈正相关，但两者相关程度较弱，多项研究已表明，肠道菌群可调节体内多种炎症细胞因子，双歧杆菌是肠道内数量最多的益生菌，可促进B细胞的转化和IL-10、TGF-β的分泌[21]。 乳酸杆菌则可对TNF-α和IL-6产生刺激作用[22]。Kosiewicz等[23]证明乳酸杆菌可以通过机体内黏膜免疫反应促进TGF-β的分泌，提高Treg细胞的水平，由此可见，肠道菌群在机体促炎及抗炎过程均发挥作用，在SLE状态下 TGF-β与乳酸杆菌之间可能有关，但两者的关系受体内其他菌群、细胞因子及治疗过程中药物的影响，因此两者之间更深层次的关系还有待进一步研究。

激素和羟氯喹是目前治疗SLE的基础药物。研究发现，激素进入靶细胞胞浆后可与胞浆内的特异性受体结合，调节某些基因的转录活性，可抑制淋巴细胞中活化蛋白-1(AP-1)及核因子-κB等转录因子，从而下调编码炎症性细胞因子的基因表达，发挥抗炎及免疫抑制作用。羟氯喹则可通过抑制炎症细胞的趋化和浸润，从而发挥有效抗炎作用，该过程涉及TNF-ɑ、IL-1和 IL-6等炎症因子。本研究显示，SLE患者经激素联合羟氯喹治疗3个月后的SLEDAI评分降低，外周血中IL-17水平下降，但仍高于正常对照组，TGF-β的表达水平明显提高，但仍低于正常对照组，以上结果表明激素联合羟氯喹可有效改善患者的病情，且IL-17、TGF-β等炎症因子在SLE的发病及治疗机制中发挥重要作用，激素和羟氯喹可分别通过抑制B细胞的分化及下游炎症细胞因子的形成，改善Treg细胞的功能，抑制机体炎症状态。本研究显示，SLE患者治疗后，双歧杆菌、乳酸杆菌的数量减少，大肠埃希菌的数量无变化，提示SLE患者应用激素和羟氯喹治疗，虽然在短期内可明显控制病情，但长期应用可能会使肠道菌群失调状态进一步加重，目前有关羟氯喹是否具有抗菌作用一直备受争议。早在上世纪七十年代，有关学者就提出在体外环境下，羟氯喹等抗疟药可抑制大肠埃希菌、藤黄微球菌DNA聚合酶的形成，数十年后Wolf等[24]则发现，奎宁没有表现出对大肠埃希菌的抗菌活性。Huang等[25]观察无菌小鼠及黏蛋白基因2(Muc2)敲除的小鼠模型，当注射地塞米松4周后，发现小鼠体内黏蛋白表达下降。推测其机制可能是应用激素及羟氯喹治疗后，抑制自身抗体产生，从而减轻自身炎症状态，调节机体免疫，并对肠黏膜相关组织内黏膜免疫产生影响，进一步影响肠道菌群的免疫耐受机制，导致肠道菌群的结构和功能发生改变，本研究在自身对照基础上研究两者之间的潜在联系，证实了在SLE病理性自身免疫炎症及治疗作用下肠道菌群存在失调状态。

综上所述，本研究通过荧光定量PCR及ELISA的方法, 对SLE患者肠道中大肠埃希菌、双歧杆菌、乳酸杆菌以及外周血IL-17、TGF-β进行精确定量，结果提示IL-17、TGF-β等炎症因子以及肠道菌群的结构和功能均可能参与SLE的发病及其治疗变化机制，本研究有望在SLE的发病机制、靶点治疗及减少药物不良反应方面提供新的思路。

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(本文编辑：林燕薇)

Correlation between systemic lupus erythematosus and gut microbiota

LiMiao,FuBingbing,WuXia,HuZekun,SunXiaopeng.

DepartmentofRheumatology,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154000,China

,SunXiaopeng,E-mail:SXP_JMS7097@163.com

Objective To analyze the relationship among systemic lupus erythematosus (SLE), gut microbiota, inflammatory cytokines and disease activity, and to explore the effect and potential mechanism of glucocorticoid combined with hydroxychloroquine therapy on their relationship. Methods Twenty five healthy individuals (control group) and 30 patients with new-onset SLE (SLE group) were recruited in this study. Patients in the SLE group received combined therapy of glucocorticoid and hydroxychloroquine for three months. Fecal samples were obtained before and after corresponding treatment in two groups. SYBR Green I real-time PCR was performed to measure the quantity of the Escherichia coli, Baeteroides and Lactobacillus. The expression levels of IL-17 and TGF-β in peripheral blood were detected by ELISA. The disease activity of SLE patients was evaluated by SLE disease activity index (SLEDAI). Results Compared with the control group, the copies of Escherichia coli in SLE patients were significantly increased, whereas the quantity of Baeteroides and Lactobacillus was significantly decreased (allP<0.01). The level of serum IL-17 was significantly up-regulated (P<0.05), and positively correlated with SLEDAI score (r=0.699,P<0.05). The level of serum TGF-β was significantly down-regulated (P<0.05), and positively correlated with the copies of Lactobacillus (r=0.416,P<0.05). After 3-month corticosteroid combined with hydroxychloroquine therapy, the quantity of Baeteroides and Lactobacillus was further reduced (bothP<0.05), while no significant change was observed in the copies of Escherichia coli (P>0.05). In SLE patients, SLEDAI score was reduced (P<0.05) and the level of serum IL-17 was down-regulated (P<0.01), still significantly higher than that in the control group (P<0.01). The level of serum TGF-β was up-regulated (P<0.01), still lower compared with that in the control group (P<0.05). Conclusions SLE patients present with evident state of intestinal dysbacteriosis. Combined therapy of glucocorticoid and hydroxychloroquine can significantly alleviate the severity of SLE, whereas may further aggravate the state of intestinal dysbacteriosis. The inflammatory cytokines of IL-17 and TGF-β may be involved in the pathogenesis and therapeutic mechanism of SLE. Lactobacillus is probably correlated with TGF-β in SLE patients.

Systemic lupus erythematosus; Gut microbiota;

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.11.004

佳木斯大学研究生科技创新重点项目(LZR2014_019)

154000 佳木斯，佳木斯大学附属第一医院风湿免疫科

，孙晓鹏， E-mail：SXP_JMS7097@163.com

2016-05-06)