椰子织蛾高毒力金龟子绿僵菌菌株的筛选

孙晓东, 李富恒, 阎 伟, 李朝绪, 吕朝军, 覃伟权*

(1. 中国热带农业科学院椰子研究所, 文昌 571339; 2. 东北农业大学生命科学学院, 哈尔滨 150030)



椰子织蛾高毒力金龟子绿僵菌菌株的筛选

孙晓东1,2, 李富恒2, 阎 伟1, 李朝绪1, 吕朝军1, 覃伟权1*

(1. 中国热带农业科学院椰子研究所, 文昌 571339; 2. 东北农业大学生命科学学院, 哈尔滨 150030)

椰子织蛾是为害热带地区棕榈科植物的重要害虫,本试验对从海南省陵水县采集的椰子织蛾僵虫上分离得到的4株金龟子绿僵菌进行了分子生物学鉴定,并测定了其对椰子织蛾3龄幼虫的室内生物活性,筛选出了高毒力菌株LS-Y1。试验结果表明,经NCBI BLAST比对,4株菌株的rDNA-ITS序列与GenBank中已知基因序列相似性分别为99%、100%、99%、99%。菌株LS-Y1 处理椰子织蛾3 龄幼虫后6 d 的LC50为4.41×106个/mL。6.25×106、1.25×107、2.5×107、5×107和1×108个/mL 浓度处理下,金龟子绿僵菌LS-Y1 对椰子织蛾3龄幼虫的 LT50分别为5.77、4.88、4.43、3.82和3.36 d。该菌株对椰子织蛾幼虫具有较高毒力,具有较好的生防潜力。

金龟子绿僵菌; 椰子织蛾; 分子鉴定; 毒力

椰子织蛾(OpisinaarenosellaWalker)(又称椰子木蛾、黑头履带虫、椰蛀蛾、食叶履带虫[1]),属鳞翅目(Lepidoptera)织蛾科(Oecophoridae),英文名coconut black headed caterpillar,是一种严重为害椰子、槟榔、蒲葵、中东海枣、大王棕等棕榈作物的外来入侵有害生物[2],目前主要分布于印度、泰国、印度尼西亚、马来西亚、斯里兰卡、孟加拉、缅甸、巴基斯坦等地[3]。椰子织蛾幼虫取食叶片,严重时整个树冠被啃食从而导致植株发育缓慢、果实产量大幅减少甚至绝产[4]。近年来棕榈作物作为经济作物和园林景观植物从国外大量引入并在我国南方大面积种植,导致椰子织蛾在我国暴发的可能性越来越大[5],目前海南、广西、广东三省已有大面积为害的报道[6]。2014年3月椰子织蛾被列为全国林业危险性有害生物。

目前椰子织蛾主要还是依靠化学防治[4, 7],化学药剂虽然在一定程度上可以快速控制该虫,但是其引起的残留、抗性与再猖獗等问题严重影响到自然环境与人类的健康。利用寄生蜂防控椰子织蛾在印度、斯里兰卡等国取得了一定的效果,但是国内尚未有效开展优质寄生蜂品种引进与大面积饲养、释放[3, 8],因此如何结合国内现有研究基础寻找更加科学有效的控制椰子织蛾为害的生物防治手段显得尤为重要。金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)寄主范围广泛,能寄生直翅目、膜翅目、同翅目、双翅目、鳞翅目、鞘翅目以及半翅目等7个目、42个科、约200余种昆虫、线虫及螨类[12]。金龟子绿僵菌是在生物防治上使用最为广泛的昆虫病原真菌之一,在森林、农作物以及公共卫生害虫防控方面都进行了应用效果的评估。如张泽华等人利用金龟子绿僵菌生防制剂成功防控蛴螬[11]、蝗虫[10]、叶蝉[12]等害虫,Amerasan等[9]发现金龟子绿僵菌对疟疾的主要媒介昆虫伊蚊有着十分明显的防控效果。金龟子绿僵菌作为一种重要的生防真菌具有寄生物种多、适应性强、致病周期短、靶标性强、对人类和牲畜不会造成毒害以及环境友好的特点。目前利用金龟子绿僵菌防控椰子织蛾尚未见相关报道。

本文针对椰子织蛾在海南省南部市县为害严重的现状,因地制宜地收集了对椰子织蛾有毒力的金龟子绿僵菌菌株,进行了高致病性金龟子绿僵菌菌株筛选与分子生物学鉴定,旨在提供优良菌株用于生产防治棕榈科植物的菌剂,为椰子织蛾的生物防控提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

PDA培养基[11]与SDAY选择性培养基(4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉、2%琼脂、100 μg/mL链霉素、100 μg/mL青霉素、多菌灵0.8 μg/mL)。

1.1.2 引物

由生工生物工程股份有限公司(广州)合成真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)引物ITS 4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),ITS 5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)[13]扩增致病菌的ITS 1-5.8S-ITS 2 rDNA区。

1.1.3 菌株

供试菌株分离自海南省陵水县椰子织蛾幼虫僵虫。剥开椰子卷曲叶片,收集椰子织蛾幼虫僵虫并进行保湿培养和菌株的分离,然后转接到SDAY选择性培养基上进行筛选,经显微形态学鉴定为绿僵菌后进行纯化培养,共分离得到4株金龟子绿僵菌菌株,对照菌株R3是由红棕象甲僵虫中分离得到的金龟子绿僵菌[16],相关信息参见表1。

表1 供试金龟子绿僵菌菌株编号、寄主信息、采集时间与采集地

1.1.4 主要试虫

椰子织蛾由本实验室人工饲养,饲料为新鲜椰子叶片,恒温气候箱中饲养条件:温度为(28±1)℃,RH为饱和湿度,光周期为L∥D=12 h∥12 h。

1.1.5 主要试剂

2×TaqMix、凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司;真菌基因组DNA快速抽提试剂盒购自Sangon Biotech 公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化

取采集的椰子织蛾僵虫样品,先用70%乙醇消毒1 min,无菌水清洗后再用0.1%的氯化汞表面消毒30 s,无菌水清洗3次,挑取少许僵虫组织接种于SDAY选择性培养基上,于(28±1)℃恒温气候箱中倒置培养3～4 d,选取单孢子接种于PDA培养基进行纯化,每皿3点,呈三角形排列,石蜡膜密封10℃保存。

1.2.2 金龟子绿僵菌基因组DNA的提取与鉴定

将纯化后的金龟子绿僵菌接种在PDA培养基上,26℃恒温条件下培养72 h,无菌条件下刮取菌体并用纱布抽滤收集菌丝,使用真菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA,将DNA沉淀溶解于300 μL无菌水中,加入RNA酶(终浓度50 μg/mL)处理溶液,使DNA充分溶解,-20℃保存备用。ITS鉴定PCR反应体系参见Song Zhangyong[14]。PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,采用Vector NTI 11软件的AlignX进行rDNA-ITS同源性分析。

1.2.3 实验室杀虫活性测定

将纯化的绿僵菌菌株在PDA培养基上画线,28℃培养10 d后,无菌条件下刮取菌体,然后使用灭菌去离子水制备成菌悬浮液(含0.1%吐温-80),将椰子叶片用清水洗净晾干,选取鲜嫩一致的椰子叶片切成15 cm的叶段,在各个浓度的混合均匀的菌悬液(含0.1%吐温-80)中浸泡5 min,晾干,放入生测瓶中,每瓶接椰子织蛾3龄幼虫30头,每个处理重复3次,28℃生化培养箱中保温,培养2 d后调查死、活虫数,并观察幼虫取食情况,调查至第6天。

2 结果与分析

2.1 5株菌株的分子水平鉴定

LS-Y1、LS-Y6、LS-G2、LS-G3、R3 rDNA-ITS序列经NCBI BLAST比对后与GenBank中已注册序列JN377427.1、NR132017.1、FJ545278.1、FJ545294.1、GU909512.1的相似性最高，分别为99%、100%、99%、99%、98%,在分子水平鉴定5株菌株均为金龟子绿僵菌,具体结果见表2。

表2 菌株的序列比对结果与对椰子织蛾幼虫的毒力1)

1) 表中数据为平均值±标准误,同列数据后不同字母者表示在0.05水平上差异显著(DMRT 法)。Data were mean±SE, values in same column followed by different letters were significantly different at 0.05 level by DMRT.2.2 5株金龟子绿僵菌菌株对椰子织蛾的毒力

经金龟子绿僵菌不同菌株配制的1.0×108个/mL孢子悬浮液处理后,椰子织蛾3龄幼虫均有死亡,第4天的累计死亡率见表2。不同金龟子绿僵菌菌株对椰子织蛾的致病性存在很大差异,菌株LS-Y1、LS-Y6、R3对椰子织蛾的毒力较高,菌株LS-Y1对椰子织蛾的致病力最高,侵染后第4天,校正死亡率为66.67%,与菌株LS-G2、LS-G3差异显著(P<0.05);菌株LS-G2对椰子织蛾的毒力最低,为17.22%。

2.3 绿僵菌菌株LS-Y1对椰子织蛾的毒力

生物测定结果显示菌株LS-Y1对椰子织蛾幼虫具有高杀虫活性,第2天中毒的椰子织蛾陆续开始死亡,死亡虫体色不变,但失去光泽,身体僵硬失去弹性。第3天部分虫体长出白色菌丝;第4天部分虫体全身长满菌丝,且有淡绿色孢子产生;第5天橄榄绿色孢子覆盖幼虫全身(图1a);而对照试虫表现食量较大,虫活跃,发育正常(图1b)。

图1 椰子织蛾3龄期染菌幼虫与健康幼虫比较Fig.1 Comparison of the diseased 3rd instar larvae of Opisina arenosella with the healthy larvae

利用IBM-SPSS 21.0软件对椰子织蛾3龄期幼虫进行半致死浓度分析,金龟子绿僵菌LS-Y1不同浓度处理椰子织蛾3龄幼虫的致死浓度回归方程为Y=4.15+1.32X,表明其致死率与浓度成正比,LC50为4.41×106个/mL,95%置信区间为2.63×106～7.41×106个/mL。在6.25×106、1.25×107、2.5×107、5×107和1×108个/mL 孢子浓度处理下,金龟子绿僵菌LS-Y1对椰子织蛾3龄幼虫的 LT50分别为5.77、4.88、4.43、3.82和3.36 d,LT50随着孢子悬浮液浓度的增加而递减(图2)。

图2 金龟子绿僵菌菌株LS-Y1 不同浓度处理的椰子织蛾3龄幼虫逐日累计死亡率Fig.2 The daily accumulative mortalities of the 3rd instar larvae of Opisina arenosella treated with the strain LS-Y1 at different spores concentrations

3 讨论

本研究中的5株金龟子绿僵菌菌株在1×108个/mL 孢子浓度处理下,对椰子织蛾的室内毒力差异较大,其中分离自第一寄主椰子织蛾的菌株LS-G2与LS-G3对椰子织蛾毒力明显低于分离自第二寄主的红棕象甲菌株R3,表明金龟子绿僵菌的毒力高低与是否是分离自第一寄主并无直接联系。同时,试验发现分离自红棕象甲僵虫的菌株对椰子织蛾也有较高的毒力,基于棕榈作物害虫椰子织蛾、红棕象甲有混合发生的实际情况[15],今后有必要开展以上菌株对红棕象甲的致病性测定工作,以拓宽菌株的防治范围。

采用本试验筛选的金龟子绿僵菌菌株LS-Y1 1×108个/mL 孢子浓度处理椰子织蛾，4 d后累计死亡率接近66.67%,说明该菌株对椰子织蛾具有相对较高的毒力,但由于田间气候条件复杂,尚需研究适合于田间应用的金龟子绿僵菌菌剂、施用方法等,今后将就该菌株对椰子织蛾不同虫态的毒力、不同剂型与环境的兼容性、与其他生防产品的协调防控等方面开展进一步的研究。

本试验发现了一株对椰子织蛾幼虫有较高毒力的绿僵菌菌株LS-Y1,这是首次报道金龟子绿僵菌对棕榈科作物重要害虫椰子织蛾幼虫有生物活性,表明其具有较大的生防潜力。但是尚未测定该菌株对椰子织蛾成虫的生物活性,下一步将优化试验方案进一步验证该菌株对椰子织蛾成虫的生物活性。

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(责任编辑:杨明丽)

Screening of highly toxic strains of Metarhizium anisopliae againstOpisinaarenosellaWalker

Sun Xiaodong1,2, Li Fuheng2, Yan Wei1, Li Chaoxu1, Lü Chaojun1, Qin Weiquan1

(1. Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wenchang 571339, China;2. College of Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

OpisinaarenosellaWalker is an important insect pest on palm plants in the tropical area of China. In order to find efficient biocontrol agent againstO.arenosella, fourMetarhiziumanisopliaestrains with good cultural characters were obtained from dead overwinteringO.arenosellalarvae collected from Lingshui, Hainan Province. The strains were identified by molecular method and their toxicities against the 3rd instar ofO.arenosellawere investigated in laboratory. Strain LS-Y1 demonstrated high toxicity againstO.arenosella. NCBI BLAST with the rDNA-ITS fragments from the four tested strains revealed that the nucleotide sequences of these genes have the similarity of 99%, 100%, 99% and 99% with the sequences of JN377427.1, NR132017.1, FJ545278.1, FJ545294.1, respectively. LC50value of LS-Y1 on the 3rd instar larvae ofO.arenosellawas 4.41×106conidia/mL 6 days after treatment. The LT50values of LS-Y1 on the 3rd instar larvae ofO.arenosellaat the spores concentrations of 6.25×106, 1.25×107, 2.5×107, 5×107and 1×108conidia/mL were 5.77 d, 4.88 d, 4.43 d, 3.82 d and 3.36 d, respectively. These results showed that the strain LS-Y1 was highly toxic againstO.arenosellalarvae, which was the promising candidate in the biological control ofO.arenosella.

Metarhiziumanisopliae;Opisinaarenosella; molecular identification; toxicity

2015-12-03

2016-02-18

海南省重大科技项目(ZDZX2013008)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金

S 436.67

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.039

* 通信作者 E-mail: qwq268@163.com