片仔癀减轻对大肠癌小鼠移植瘤5-氟尿嘧啶治疗所致毒副作用的研究

符彩选，刘雪东，彭军，2，沈阿灵，褚剑锋，2，林久茂，2

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122）

·实验研究·

片仔癀减轻对大肠癌小鼠移植瘤5-氟尿嘧啶治疗所致毒副作用的研究

符彩选1，刘雪东1，彭军1，2，沈阿灵1，褚剑锋1，2，林久茂1，2

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122）

目的探讨片仔癀（PZH）对大肠癌小鼠移植瘤5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗所致肠道损伤及白细胞和淋巴细胞减少的影响作用。方法构建BABL／c鼠源性结肠癌细胞CT-26的小鼠皮下移植瘤模型，按照瘤体大小将小鼠随机分为对照组、PZH（250 mg／kg）组、5-FU（150 mg／kg）组和联合组，每组8只；观察小鼠的一般生活状态，记录其摄食量、体重变化和粪便状况，并根据腹泻评分标准对小鼠腹泻程度进行分级；采用HE染色观察空肠组织病理形态学变化，并根据M acpherson and Pfeiffer肠组织病理学评分标准进行肠道损伤程度分级；采用全自动血液分析仪检测外周血白细胞和淋巴细胞的数量。结果5-FU组小鼠的一般生活状态差，摄食量减少，体重减轻，且出现腹泻症状；HE染色结果发现空肠组织肠绒毛变短、肠道细胞水肿、固有层水肿、炎性细胞浸润和腺体排列不规整，偶有缺失，而对回肠和结肠组织无明显影响；外周血白细胞数和淋巴细胞数减少。PZH与5-FU联合应用，对上述5-FU所致的不良反应具有明显的改善作用，可明显增加小鼠的摄食量和体重，减轻腹泻症状，减轻肠组织病理损伤程度，抑制外周血白细胞和淋巴细胞的减少。结论PZH对大肠癌移植瘤小鼠5-FU治疗引起的肠道损伤及外周血白细胞和淋巴细胞减少等不良反应具有显著的改善作用。

大肠癌；5-氟尿嘧啶；外周血细胞；肠道损伤；片仔癀

大肠癌（包括结、直肠癌）是常见的消化道恶性肿瘤之一［1］。5-氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）为治疗大肠癌的一线化疗药［2］，在抑制或杀伤肠癌细胞的同时，对正常细胞也具有损伤作用，可引起肠道损伤和外周血白细胞及淋巴细胞的减少［3-5］。已有研究［6-8］证实片仔癀（Pien Tze Huang，PZH）能够通过多种机制发挥抗大肠癌的作用，但是其在减轻5-FU引起的肠道损伤和抑制外周血白细胞及淋巴细胞减少方面的作用尚未见报道。本文旨在探讨PZH对5-FU引起的肠道损伤和白细胞及淋巴细胞减少的影响作用，为PZH的临床应用提供进一步的实验依据。

1材料

1.1 细胞株BALB／c小鼠来源的CT-26结肠癌细胞株（目录号TCM37），购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 动物BALB／c小鼠，SPF级，雄性，4～6周龄，体质量（18±20）g，购自上海斯莱克实验动物中心，许可证号为SCXK（沪）2008-0016。置福建中医药大学实验动物中心SPF级实验室中正常喂养，恒温、恒湿、12 h光照／d。适应性喂养2 d后，进行后续实验。实验期间小鼠自由摄食、饮水。

1.3 药物片仔癀粉末（漳州片仔癀药业股份有限公司，生产批号：1009039）；5-氟尿嘧啶注射液（5-FU，上海旭东海普药业有限公司生产，规格：250 mg／10 mL）。

1.4 试剂RPMI-1640培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、Penicillin-Streptomycin（美国Thermo Fisher Scientific公司）；基质胶（美国BD公司）；0.9%氯化钠注射液（福州海王福药制药有限公司）；多聚甲醛粉末、无水乙醇、二甲苯（国药集团化学试剂有限公司）；苏木素／伊红染色液（中国索莱宝科技有限公司）；中性树胶（福州迈新生物技术开发有限公司）。

1.5 仪器超净工作台（苏州净化设备公司）；二氧化碳培养箱（德国Heraeus公司）；全自动动物血液分析仪（日本SYSMEX公司）；生物组织自动脱水机、生物组织石蜡包埋机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司）；全自动石蜡切片机、DM4000B显微镜（德国徕卡仪器有限公司）；形态学显微图像分析系统（LASV4.1）。

2方法

2.1 药物的配制PZH溶液的配制：配制前将片仔癀研磨成细粉，用生理盐水配制成浓度为25 mg／mL的溶液，超声溶解后高压灭菌，恢复至室温备用，现用现配。5-FU注射液的配制：用生理盐水配制成浓度为15 mg／mL的溶液，充分混匀后备用，现用现配。

2.2 细胞培养将鼠源性结肠癌细胞株CT26细胞培养于含10%热灭活胎牛血清（FBS）、100 U／m L青霉素和100μg／mL链霉素的RPIM1640培养基中，置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞单

层贴壁生长，至80%～90%汇合度时，以0.25%含EDTA胰蛋白酶消化，按1∶3传代培养。

2.3 移植瘤模型建立、动物分组及给药取对数生长期的鼠源性结肠癌CT26细胞制备成单细胞悬液后，以2×106／mL与基质胶1∶1混合后，按0.2mL／只，于32只BALB／c鼠右前肢腋窝处皮下接种。待瘤体长约至300～350 mm3时按照瘤体大小随机分为对照组、PZH组、5-FU组、PZH+5-FU组（联合组），每组8只。PZH按小鼠体重250 mg／kg灌胃给药；5-FU按小鼠体重150 mg／kg腹腔注射给药；对照组给予等量生理盐水灌胃和腹腔注射。各组均于分组当天开始给药，其中PZH每天灌胃1次（0.1 mL／10 g体重），连续给药4 d，5-FU只于分组当天腹腔注射1次。

2.4 标本采集各组小鼠于末次给药后禁食不禁水12 h，次日眼眶取血，将血液置于肝素钠抗凝管中，用于后续血常规检测。采用颈椎脱臼法处死小鼠后，距幽门下端15 cm处取2 cm完整空肠组织，距回盲瓣5 cm处取2 cm完整回肠组织，盲肠后端取2 cm完整结肠组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h，用于后续苏木素-伊红（HE）染色。

2.5 指标观察

2.5.1 小鼠一般生活状态观察给药期间每天观察小鼠的一般生长状况，并记录其摄食量及体重。

2.5.2 小鼠腹泻症状的观察及评分每天观察小鼠的粪便情况，并参照Liu ZZ评分标准［9］对小鼠的腹泻症状进行等级评分。

2.5.3 肠黏膜损伤程度观察采用HE染色观察各组小鼠肠组织病理形态学变化。用Leica DM4000B显微镜进行病理图像采集，并根据Macpherson and Pfeiffer肠组织病理学评分标准［10］对小鼠肠组织的损伤程度进行评分。

2.5.4 外周血白细胞和淋巴细胞分析眼眶取血，将血液置于肝素钠抗凝管中，用全自动动物血液分析仪检测其外周血白细胞数和淋巴细胞数量。

2.6 统计学处理实验数据用SPSS 18.0进行统计分析。符合正态分布的计量资料用x±s表示，多组间的比较采用单因素方差分析，2组比较采用t检验；计数资料采用确切概率法检验。

3结果

3.1 PZH对小鼠一般生活状态的影响对照组和PZH组小鼠生长状况良好，均喜活动，反应灵敏，毛发光滑。与对照组比较，5-FU组小鼠毛无光泽，少动，喜群聚，反应迟钝。与5-FU组比较，联合组小鼠仍喜活动，反应尚灵敏，毛发尚光泽。结果表明，PZH单独使用对小鼠的一般生活状态无影响，但能够显著改善5-FU化疗后小鼠的生活质量。

3.2 PZH对小鼠摄食量和体重的影响见表1和表2。

3.3 PZH对5-FU引起腹泻症状的影响结果见表3。

表1 4组每日平均摄食量比较（±s）

表1 4组每日平均摄食量比较（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与5-FU组比较，2）P＜0.05。

分组对照组PZH组5-FU组联合组n8888每日平均摄食量／g 30.97±0.25 29.43±1.05 18.00±5.461）24.47±3.561）2）

表2 4组小鼠体重变化比较

表3 4组小鼠腹泻症状比较（x±s）

表3 4组小鼠腹泻症状比较（x±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与5-FU组比较，2）P＜0.05。

分组对照组PZH组5-FU组联合组腹泻发生率／% n8888 0分1分2分3分腹泻评分／分100.0 100.0 0.0 25.0 0.0 0.0 12.5 50.0 0.0 0.0 50.0 25.0 0.0 0.0 37.5 0.0 00 2.28±0.711）1.00±0.761）2）

3.4 PZH对5-FU引起肠组织损伤的影响

3..4.1采用HE染色观察小鼠肠组织病理形态学变化结果见图1。

3.4.2 各组小鼠空肠组织病理学评分比较见表4。

3.5 PZH对5-FU引起白细胞和淋巴细胞减少的影响结果见图2和图3。

表4 4组小鼠空肠组织病理学评分比较（±s）

表4 4组小鼠空肠组织病理学评分比较（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与5-FU组比较，2）P＜0.05。

2分腹泻发生率／%分组对照组PZH组5-FU组联合组3分1分0分病理学评分／分8（100.0）8（100.0）0（0.0）0（0.0）n8888 0（0.0）0（0.0）1（12.5）6（75.0）0（0.0）0（0.0）3（37.5）2（25.0）0（0.0）0（0.0）4（50.0）0（0.0）00 2.38±0.741）1.25±0.461）2）

4讨论

中医学认为，5-FU在治疗大肠癌的同时，亦损伤机体正气，损伤中阳，致使脾胃纳运失司，升降失调。现代医学认为：脾脏是重要免疫器官，而化疗所致的脾胃损伤，不仅会引起肠道损伤，亦将导致外周血中白细胞及淋巴细胞的减少。本研究结果表明：5-FU化疗后，小鼠出现活动减少、摄食量减少、体重减轻、腹泻、白细胞和淋巴细胞减少等毒副反应，与临床上出现的毒副反应基本一致。进一步通过HE染色结果发现：5-FU组空肠组织肠绒毛断裂、腺体排列不规整、固有层水肿、肠道细胞水肿和炎性细胞浸润。近年来，大量的临床研究和实验研究表明：中药作为辅助用药与化疗药联合应用在治疗肿瘤方面具有独特的优势，尤其在降低化疗引起的毒副作用、提高化疗的疗效和改善患者的生活质量方面优势明显［11－12］。研究结果提示：PZH与5-FU联合应用，不仅显著改善5-FU化疗后小鼠的生活质量，而且显著改善5-FU引起的肠道损伤和抑制白细胞和淋巴细胞的减少。PZH由田七、麝香、牛黄、蛇胆等组成，具清热解毒、消肿止痛、活血化瘀之功效，在抑制肿瘤的作用中具有整体调节特点，可通过多靶点和多途径发挥作用。本研究提示PZH对5-FU的减毒作用可能是通过对维持机体平衡而起效，如维持机体的免疫功能等，但其具体的作用环节和作用机制还有待于进一步研究。

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R285.6

A

1000-338X（2016）04-0031-03

2016-06-08

福建省自然科学基金（2015J01337）

符彩选（1989—），女，研究生，主要从事中药抗肿瘤的机制研究。

林久茂（1975—），男，医学博士，副研究员，硕士生导师。E-mail：jiumaolin@hotmail.com