茶树良种场不同品种的SSR鉴定研究

姜燕华，张成才，成 浩*

(1.宁波市宁海县农林局，浙江 宁波 315600；2.中国农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心，浙江 杭州 310008)



茶树良种场不同品种的SSR鉴定研究

姜燕华1，张成才2，成 浩2*

(1.宁波市宁海县农林局，浙江 宁波 315600；2.中国农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心，浙江 杭州 310008)

以宁海县桥头胡镇汶溪茶叶良种场的15个茶树品种的叶片为试验材料，每个待鉴定品种随机选择3～4个单株作为待测样本，以国家茶树种质资源圃品种作为标准品种，采用SSR技术检测待测品种与档案记载情况是否相符。试验结果表明：通过21对SSR引物的PCR扩增，良种场中的‘龙井43’、‘安吉白茶’和‘迎霜’的SSR标记数与其对应的标准品种完全一致，说明这3个品种保持原品种的特征特性；‘歌乐茶’、‘劲峰’和‘平阳特早’3个品种部分样本的标记数与其对应的标准品种一致，说明这3个品种中的部分单株出现某种程度的变异；‘早逢春’、‘碧云’、‘竹紫春’、‘乌牛早’、‘水谷茶’和‘福鼎大白茶’6个品种的标记数与其对应的标准品种出现不一致，说明这6个品种在良种场繁育过程中出现同名异物或同物异名的错误；良种场中的‘银片’、‘鸠坑种’和‘紫笋’无法确定其是否属于相应的标准品种，说明在良种收集过程中，无法弄清品种的来源。通过本研究纠正了品种收集过程中出现的错误，指出了品种繁育过程中出现的突变。

茶树；SSR；品种鉴定；无性系

茶树是重要的经济作物，在我国的种植栽培历史悠久。19世纪以前，我国的茶产业一直处于世界领先地位，而后逐渐衰落，直到新中国成立之后才进入蓬勃发展的时期。近50年来，我国茶产业的发展基本可以分为3个阶段：扩大种植面积阶段(1950～1978年)、提高单产阶段(1979～1989年)和提高质量阶段(1990年至今)[1]。在第一阶段中，我国的茶园面积成倍增加，各地开辟了大量的新茶园。其中，一部分为生产茶园；另一部分为茶树良种场，陆续引种有不同的茶树良种，为一定区域内的茶园提供种苗保障。长期以来，一些当时成立的茶树良种场，由于人员流动和疏于管理，已经失去了作为良种场的功能，转而成为生产茶园，造成了资源的浪费。如何对这些良种场进行评价，特别是如何对其所种茶树良种进行鉴别，以考察其是否具有恢复茶树良种场功能的潜质，成为一个亟待解决的问题。

近年来，随着生物技术的发展，分子标记技术已被广泛应用于小麦[2-3]、水稻[4]、玉米[5-7]、茶叶[8-13]等多种作物研究，尤其是在遗传多样性、亲缘关系、品种鉴别领域使用最多。其中，简单重复序列标记(SSR，simple sequence repeats)，由于检测方便、鉴别能力高，成为最好的品种鉴别方法之一[5,14]。在茶树品种鉴别方面，杨阳等使用SSR标记、刘本英等使用ISSR(inter simple sequence repeats)标记，分别构建了湖南省和云南省主要茶树品种的指纹图谱，为这些茶树品种的鉴别提供了依据[15-16]。张成才等使用SSR标记对浙江省主要无性系茶树品种的鉴定进行了研究，并且提出了相应的鉴定标准[17]。

宁海县桥头胡汶溪茶叶良种场位于宁波市宁海县桥头胡镇，始建于1974年，陆续引种有‘劲峰’、‘迎霜’、‘乌牛早’等10余个茶树良种，直至20世纪90年代初达到如今的规模。多年来，该良种场由于人员流动、档案不全，一直没能得到很好地利用。为了确定该良种场所种茶树品种与部分档案记载是否一致，藉此评估其对当前宁海县茶叶生产、种苗繁育等方面的潜在意义，本实验使用SSR标记的方法，根据部分档案推测的品种名称，对该良种场种植的15个茶树品种进行验证。

1 材料和方法

1.1 取样

‘劲峰’、‘迎霜’、‘乌牛早’等15个待鉴定品种，每个品种分别从茶行中随机选3～4个单株共59个单株，取叶片作为待鉴定样品(表1)。

从茶树国家种质资源圃中，取与待鉴定材料相应的各品种1芽2叶嫩梢，作为品种鉴定的标准样。资源圃没有保存‘银片’品种，因此没有取到该品种的标准样；资源圃没有保存‘水谷茶’品种，保存有‘水古茶’，因此采‘水古茶’为标准样(表1)。

表1 供试材料信息

1.2 基因组DNA的提取及PCR扩增

采样后，将样品迅速放于液氮中冷冻，使用天根生化科技有限公司(DP305)的植物基因组DNA试剂盒提取各份材料的基因组DNA。检测浓度后，稀释到20 ng·μL-1保存备用。

PCR扩增使用10 μL反应体系，包括DNA模板2 μL，上下游引物各0.2 μL，Taq酶0.2 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP 0.5 μL，加ddH2O至10 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4 min，94℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s共35个循环，最后72℃延伸10 min。

1.3 电泳检测及数据处理

使用10%聚丙烯酰胺凝胶，在120 V的电压下电泳90 min，银染显色[18-19]。显色后，人工读带，条带由大到小分别记为A、B、C、D等，无条带或者带型难以辨认记为“..”，在Excel中进行数据处理，使用Popgen32软件构建遗传聚类图。

1.4 品种判定标准

本试验，参考水稻[20]和茶树[17]品种鉴定方法对样品品种进行判定：①某一单株与标准品种差异标记数=0，则判定该单株属于这一品种；②某一单株与标准品种差异标记数=1，则判定该单株疑似属于这一品种；③某一单株与标准品种差异标记数≥2，则判定该单株不属于这一品种。

2 结果与分析

本研究使用实验室前期筛选过的多态性高、带型清晰的21对SSR引物(表2)，分别对15个待鉴定品种的59个单株和14个标准样进行PCR扩增。然后，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，银染显色(图1)。人工读带并构建带型模拟图(图2)，然后使用Popgen32软件构建遗传聚类图(图3)。差异标记数统计结果见表3，检测结果汇总见表4。

表2 21对引物信息

待鉴定品种‘安吉白茶’(AJBC)，4个样本相互之间的带型完全一致，而且与标准样品完全一致，因此认为这4个样本所代表的群体为无性系群体，并且属于‘安吉白茶’品种；同样地，待鉴定品种‘龙井43’(LJ43)，4个样本相互间带型一致，且与标准样品一致，认为这4个样本所代表的群体为‘龙井43’的无性系群体。待鉴定品种‘迎霜’(YS)，4个样本间带型一致，同时与标准样品带型一致，认为这4个样本所代表的群体为‘迎霜’的无性系群体。

图1 引物5077部分样品谱带Fig.1 SSR fingerprints of samples using primer 5077

图2 21个SSR标记在待定品种及标准品种中的带型模拟图Fig.2 Simulating diagrams of 21 SSR markers on farm collection and standard varieties注：左侧第一列为待鉴定品种编号，每个编号对应的一行为该品种4个样本和标准样品的带型；图顶部的一行数字为SSR标记引物编号，每个编号所对应的列，为这个标记在每个样本中的带型。Note: Codes on left column are cultivars to be identified, corresponding row for each code shows banding patterns of 4 samples of each cultivars and its reference standard; numbers on top of diagram indicate SSR markers, each column underneath shows marker banding patterns for each corresponding sample.

待鉴定品种‘歌乐茶’(GL)，4个样本中GL3和GL4带型一致且与标准样品带型一致，与GL1有1个标记存在差异，与GL2有2个标记存在差异，聚类结果发现以上4个样本与标准样品一起聚为一类。以上结果表明，这4个样本所代表的群体为无性系群体，其中混杂有亲缘关系较近的单株，该群体属于‘歌乐茶’品种。

待鉴定品种‘劲峰’(JF)，4个样本中JF3和JF4与标准样品带型完全一致，JF2与标准样品有2个标记差异，而JF1与标准样品差异标记数为13个。因此JF3和JF4为‘劲峰’；而JF1和 JF2不属于‘劲峰’品种，而且聚类分析结果表明，JF1与其他3个样本以及标准样品间的亲缘关系较远，JF2与JF3、JF4和标准样品聚为一类。以上结果表明，这4个样本所代表的群体为‘劲峰’的无性系群体，但是群体里面混杂有亲缘关系较远的单株。

待鉴定品种‘平阳特早’(PYTZ)，4个样本中，PYTZ1、PYTZ2和PYTZ4之间的带型一致，且与标准样品存在1个标记的差异；PYTZ3与其他3个样本存在2个标记的差异，与标准样品存在3个标记的差异，聚类分析发现PYTZ3与其他3个样本以及标准样品的亲缘关系较近。因此认为PYTZ1、PYTZ2和PYTZ4疑似属于‘平阳特早’品种；PYTZ3不属于‘平阳特早’品种。以上结果表明，这4个样本所代表的群体，疑似属于‘平阳特早’品种的无性系群体，但其中混杂有亲缘关系较近的单株。

表3 15个待鉴定品种的59个单株与标准样品差异标记数统计

待鉴定品种‘早逢春’(ZFC)，4个样本中，ZFC2和ZFC3之间的带型一致，但与标准样品存在13个标记的差异；ZFC1与以上两个样本存在9个标记的差异，与ZFC4存在7个标记的差异，与标准样本存在12个标记的差异；ZFC4与ZFC2和ZFC3之间存在8个标记的差异，与标准样品存在13个标记的差异；聚类分析发现4个样本聚为一类，但与标准样品亲缘关系较远。以上结果表明，这4个样本所代表的群体为无性系群体但不属于‘早逢春’，而且其中混杂了亲缘关系较近的单株。

待鉴定品种‘碧云’(BY)，4个样本中，BY3和BY4带型一致，与BY2存在1个标记的差异，与BY1存在7个标记的差异；4个样本与标准样品存在5～9个标记的差异；聚类分析发现，4个样本与标准样品一起聚为一类。以上结果表明，这4个样本所代表的群体，为无性系群体，该群体里面混杂有亲缘关系较近的单株，该群体与‘碧云’品种亲缘关系较近，但是不属于‘碧云’品种。

待鉴定品种‘水谷茶’(SG)，4个样本中SG2和SG3带型一致，与SG1和SG4均存在1个标记的差异；SG1和SG4间存在2个标记的差异；4个样本与标准样品‘水古茶’存在13～14个标记的差异，聚类分析发现4个样本与标准样品‘水古茶’亲缘关系较远。以上结果表明，这4个样本所代表的群体属于无性系，但是与标准样品‘水古茶’并非一个品种。

待鉴定品种‘竹紫春’(ZZC)，4个样本中ZZC1和ZZC3带型一致，与ZZC2存在一个标记的差异，与ZZC4存在10个标记的差异；ZZC2和ZZC4存在11个标记的差异；4个样本与标准样品存在10～14个标记的差异；聚类分析发现ZZC1、ZZC2和ZZC3聚为一类，ZZC4和标准样品均与它们的遗传关系较远。以上结果表明，这4个样本所代表的群体，为无性系群体，但混杂有亲缘关系较远的个体，而且该群体不属于‘竹紫春’品种。

待鉴定品种‘乌牛早’，3个样本中WNZ1和WNZ2有2个标记存在差异，与WNZ3存在5个标记的差异；WNZ2和WNZ3存在6个标记的差异；3个样本与标准样品有11～13个标记存在差异；聚类分析发现3个样本聚为一类，但与标准样品亲缘关系较远。以上结果表明，这3个样本所代表的群体可能属于无性系群体，但其中混杂有亲缘关系较近的单株，而且该群体并非‘乌牛早’品种。

待鉴定品种‘银片’(YP)，4个样本中YP1、YP2和YP4带型完全一致，与YP3存在1个标记的差异。由此，认为这4个样本所代表的是一个无性系群体，但由于本试验没有‘银片’标准样品，不能确定该群体是否属于‘银片’品种。

待鉴定品种‘紫笋’(ZS)，4个样本中ZS1、ZS2和ZS4间的带型一致，与ZS3存在1个标记的差异，与标准样品存在7个标记的差异，聚类分析发现4个样本均与标准样品‘紫笋群体’(群体种)聚为一类。结果表明，这4个样本所代表的群体为无性系群体，该群体可能由紫笋群体种中的某一单株扩繁而成，因而与标准品种亲缘关系较近，根据本实验结果难以确定该待测品种为‘紫笋群体’品种。

待鉴定品种‘福鼎大白’(FDDB)，4个样本相互之间的差异标记数为14～17个，与标准样品的差异标记数为9～15个，聚类分析发现FDDB2与标准样品聚为一类，而其余样本散见于聚类图中。结果表明，这4个样本所代表的群体为群体种，由于群体种遗传背景复杂，因此无法根据SSR标记确定这4个样本是否属于‘福鼎大白’。同样类似的还有待鉴定品种‘鸠坑’(JK)，4个样本间差异标记数为10～15个，与标准样品存在13～14个标记的差异，聚类分析发现，4个样本聚为一类，因此认为此4个样本所代表的群体为群体种，但无法确定这4个样本是否属于‘鸠坑群体种’。

图3 使用popgen32软件构建的遗传聚类图。Fig.3 Cluster diagrams of cultivars constructed using Popgen 32 software based on data of 21 SSR loci注：红色圆圈表示标准样品位置。Note: Red dots represent standard varieties.

表4 验证结果汇总

3 讨论

本试验在取样过程中发现，部分茶树品种混杂有表型明显不一致的单株，结果也表明，部分品种的确存在杂株。在茶树种苗繁育过程中，良种场通常作为母本园，为种苗繁育提供扦插穗条。茶树繁殖系数大，这些杂株会同真实品种一起大量扩繁，经销售流入生产茶园，导致茶树间存在性状差异，最终影响茶叶产量和品质。近年来，本实验室在多地取样的过程中，发现有些品种存在名称与事实不符的情况，给生产者和研究者带来了很大的困扰。因此，在建立良种场的过程中，对新引种的品种一定要严格筛查，首先要保证该品种确为目标品种，然后要剔除那些非目标品种的单株，保证所种植品种的真实性和纯度，从源头上保证扩繁后的茶苗性状一致。

研究发现，‘龙井43’、‘安吉白茶’、‘歌乐茶’、‘迎霜’、‘劲峰’和‘平阳特早’等6个待鉴定品种与档案记载的标准样品一致，然而‘歌乐茶’、‘劲峰’和‘平阳特早’3个品种中混杂有其他品种单株。‘早逢春’、‘碧云’、‘竹紫春’、‘乌牛早’和‘福鼎大白茶’等5个待鉴定品种，与档案记载的标准样品不一致，并非档案所述品种。待鉴定品种‘水谷茶’的4个样本均非‘水古茶’。另外，待鉴定品种‘银片’没有取到相应的标准样品，因此不能确定其4个样本是否属于‘银片’品种。

本研究中部分待测品种与标准样品存在遗传上的差异，但在聚类时却聚在一起，表明其亲缘关系较近，推测这些混杂的单株可能是相应标准品种的有性后代(如本试验中‘紫笋’品种)，或其品种繁殖来源于相近或同一品种。如本研究中‘碧云’品种，它是由云南大叶种天然杂种中单株选育而成。云南大叶种是茶树育种中常用的材料，通过其育种出的后代具有相似的遗传背景，因此在进行遗传聚类分析时这些后代往往聚在一起。目前，我国国家级茶树良种中，除了无性系品种，还包括‘鸠坑种’、‘祁门种’、‘龙井种’和‘紫阳种’等多个有性系品种，这些品种经自然杂交的种子扩繁而成，遗传背景非常复杂[21]。因此，很难根据SSR标记的差异数对个别单株进行比较准确的鉴定。本研究中，4个鸠坑种的样本聚为一类，然而与其标准样品的遗传关系较远，由于其遗传背景复杂，尽管遗传关系较远，仍很难明确的得出待鉴定品种是否属于‘鸠坑种’的结论。另外，本研究中取‘紫笋群体’(群体种)作为待鉴定品种‘紫笋’的标准样，4个样本ZS1、ZS2和ZS4间的带型一致，ZS3存在1个标记的差异，由此推测该品种可能为无性系品种，然而聚类分析发现，4个待鉴定样本与标准样聚为一类，因此无法明确认定待鉴定品种‘紫笋’是否属于‘紫笋群体’。以上结果表明，有性系品种的鉴定方法，仍然需要进一步探索。

本研究使用SSR的方法，对宁海县桥头胡汶溪茶叶良种场的15个茶树品种与档案记载是否一致进行了研究，纠正品种收集过程中出现的错误，为该良种场茶树资源的充分利用提供了理论依据，也为其他类似研究提供借鉴。然而，本次试验每个待鉴定品种仅随机选择了3～4个单株作为样本，而且并未开展形态学方面的调查研究，由于茶园部分品种混杂度较高，导致很难做到比较全面的评价。

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SSR Cultivar Identifications of Premium Teas

JIANG Yan-hua1, ZHANG Cheng-cai2, CHENG Hao2*

(1.AgriculturalandForestryBureauofNinghaiCounty,NingboZhejiang315600,China; 2.Tearesearchinstitute,ChineseAcademyofAgricultureSciences/NationalCenterforTeaImprovement,HangzhouZhejiang310008,China)

SSR was applied to determine the authenticity of 15 tea cultivars at a farm for preserving premium tea plants. The leaves from 3 to 4 individual plants of each cultivar were randomly collected for the test to compare with those from the respective standard varieties preserved at the China National Germplasm Tea Repository in Hangzhou. Twenty SSR markers were selected for the analysis and comparison. It was found that Longjing 43, Anjibaicha, and Yingshuang teas, as well as a few Gelecha, Jinfeng, and Pingyang Tezao plants, were genetically identical with the

tandards, and 6 cultivars of Zaofengchun, Biyun, Zhuzichun, Wuniuzao, Shuigucha, and Fuding Dabaicha deviated from the standards, while the identifications for Yinpian, Jiukengzhong, and Zisun could not be determined. The deviations suggested possible errors in cultivar collection, mislabeling, and/or mutation occurred during cultivation of the cultivars at the farm. The results provided the basic information for a full and accurate utilization of the collected germplasms in the repository farm. They also indicated that the genotypes and cluster diagram obtained from the SSR method could adequately be used to preliminarily identify the clonal tea cultivars. For the sexual variety, however, further study is required.

tea; SSR; cultivar identification; clonal

2016-07-01 初稿；2016-08-11 修改稿

宁波市林业科技项目(2014L02)。

姜燕华(1984-)，女，农艺师，研究方向：茶树种质资源与遗传育种。

*通讯作者：成浩(1962-)，男，研究员，研究方向：茶树种质资源与遗传育种。E-mail:chenghao@mail.tricaas.com

S571.1；Q311

A

2096-0220(2016)03-0105-08