高铜和高锌对饲料中益生菌活性的影响

汪祥燕，辛国芹，赵影，董佩佩，刘秀侠，徐海燕，谷巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

高铜和高锌对饲料中益生菌活性的影响

汪祥燕*，辛国芹，赵影，董佩佩，刘秀侠，徐海燕，谷巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

试验研究了饲料贮存过程及饲料中添加高水平铜和锌对本实验室保藏的9株益生菌活性的影响，从而筛选出活性高的益生菌，并以带毒平板法测定益生菌株对铜、锌的最大耐受浓度。将9株益生菌分别制成单一菌制剂添加到空白、高铜、高锌的仔猪料中，分别贮存60 d。结果表明：无论在饲料贮存过程中还是添加高铜高锌后，2株芽孢杆菌的活菌数均无显著变化。3株酵母菌对高铜、高锌的耐受性均较差。4株乳酸菌在贮存过程中活菌数有不同程度降低，且对高铜高锌有不同耐受性，戊糖片球菌、植物乳杆菌与干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌相比，对高铜、高锌抗逆性相对较强，但活性不如芽孢杆菌。

益生菌；贮存；高铜；高锌；活性

铜和锌是家禽、家畜生长的必需矿物质元素。高铜饲料能作为生长促进剂，并提高仔猪对饲料的利用率；高锌日粮可以提高断奶仔猪的免疫力和抗病力，有效减少断奶仔猪腹泻，促进仔猪生长等（黄建国和刘全，2007；Veum等，2004；Hill等，2000）。在实际应用中，活菌制剂的存活率可能受矿物质元素的影响。刘来停等（2001）报道，将含有乳酸菌和芽孢杆菌的益生菌分别添加到含有高铜的猪预混料中，在存放的第5天，乳酸菌有效活菌数迅速降低，在存放的第15天，已检测不出乳酸菌的活菌数，而芽孢杆菌受到的影响较小。菌种失活导致功效低是目前益生菌制剂的问题之一。这就要求作为益生菌制剂的菌株要有较强的抗逆性。本试验旨在通过研究实验室保藏的9株益生菌在添加到高铜、高锌饲料中的存活能力，筛选出能够耐受一定浓度矿物质的益生菌菌株，并确定其对Cu、Zn的最大耐受浓度，为动物微生态制剂的研发应用提供参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验菌株实验室保藏的9株益生菌：枯草芽孢杆菌C1-0085、枯草芽孢杆菌C1-0155、植物乳杆菌C2-0001、干酪乳杆菌C2-0003、戊糖片球菌C2-0026、鼠李糖乳杆菌C2-0038、海洋红酵母C4-0016、产朊假丝酵母C4-0021及酿酒酵母C4-0032。

1.1.2试验培养基芽孢杆菌液体培养基：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 5 g/L、葡萄糖2 g/L，pH 7.0，121℃灭菌30 min，接入纯培养的芽孢杆菌，37℃、180 r/min摇瓶过夜培养，至芽孢率95%以上。

乳酸菌液体培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏5 g/L、柠檬酸铵2 g/L、乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾5 g/L、硫酸锰0.2 g/L、硫酸镁0.5 g/L、吐温-80 1 g/L，pH 6.0，121℃灭菌30 min，接入纯培养的乳酸菌，37℃静置培养24 h。

酵母菌液体培养基：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氢钾2 g/L，pH自然，121℃灭菌30 min，接入纯培养的酵母菌，30℃、180 r/min摇瓶过夜培养。

芽孢杆菌琼脂培养基：葡萄糖2 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂15 g/L，pH 7.0，121℃灭菌20 min。

乳酸杆菌琼脂培养基（LBS）、乳酸球菌琼脂培养基（EF）及孟加拉红培养基均为市售。

1.1.3试验菌剂将9株益生菌分别接种于相应的液体培养基中，培养好的9株菌液分别于8000 r/min离心10 min，收集菌泥。然后分别与奶粉溶液（奶粉∶蔗糖=25∶8）混匀，冻干机冻干，制得单一益生菌菌剂。

1.2试验方法

1.2.1贮存过程中益生菌活力的测定将无抗生素、无益生素的仔猪预混料与基础日粮以一定比例混匀，制成仔猪料，分装于塑料袋中，每袋装400 g；然后将各益生菌制剂分别定量添加到仔猪料中，混合均匀，密封保存60 d，每天记录温湿度，定期取样进行饲料中活菌数的测定。

1.2.2高铜和高锌组益生菌活力的测定将200 mg/kg的铜（CuSO4）、2500 mg/kg的锌（ZnSO4）分别添加到分装的仔猪料中，添加定量菌粉，为Cu组和Zn组；将200 mg/kg的铜（CuSO4）与2500 mg/kg锌（ZnSO4）共同添加到分装的仔猪料中，添加定量菌粉，为Mix组；分别混合均匀。不添加铜、锌的作对照组（CK）。密封保存60 d，每天记录温湿度，定期取样进行饲料中活菌数的测定。

1.2.3饲料中活菌数的测定准确称取10 g样品，装入盛有90 mL 0.90%灭菌生理盐水的锥形瓶内，在摇床上振荡30 min，制成1∶10的样品溶液，将此溶液作梯度稀释后，分别吸取1.0 mL稀释菌悬液放入无菌平板中，加入适量相应培养基，充分混匀。每个梯度2个重复，室温下静置5～10 min后，将平板倒置于30℃或37℃恒温培养箱中培养24～72 h，选取30～300个菌落之间的平板进行计数。

1.2.4益生菌对铜、锌最大耐受浓度的测定采用带毒平板法，将各益生菌菌株的种子液分别稀释，芽孢菌及乳酸菌的OD600稀释到0.1左右，酵母菌的OD600稀释到0.2左右。无菌条件下，分别向平板中加入不同体积CuSO4母液（16 g/L）、ZnSO4母液（25 g/L），均加入15 mL相应固体培养基，摇匀，水平放置，至完全凝固。然后分别向平板中加稀释后菌液，铺平平板即可，多余菌液弃掉。每个浓度设2个平行，以不加离子的平板作对照。30℃或37℃恒温培养箱培养48～72 h后观察结果。

2　结果与分析

2.1饲料贮存过程对益生菌活性的影响仔猪料60 d的贮存条件为：温度10～29℃、平均湿度50%左右。定期取样，以梯度稀释法计活菌数，结果见图1。

图1　饲料贮存过程中益生菌活菌数的变化

外界因素如温度、湿度、酸度、环境的氧含量、保存时间等都不同程度地影响益生菌的活力。由图1可知，在60 d贮存周期内，随着贮存时间的延长，各菌株的活菌数有不同程度的变化。除2株芽孢杆菌C1-0085、C1-0155的活菌数基本没有变化外，乳酸菌及酵母菌的活菌数变化都较大。乳酸菌各菌株活菌数量对数值（lg cfu/g）从高到低依次为C2-0026、C2-0001、C2-0038、C2-0003，分别下降了0.18、1.79、2.56、3.49。酵母菌各菌株活菌数量对数值（lg cfu/g）从高到低依次为C4-0016、C4-0021、C4-0032，分别下降了0.62、1.70、2.13。对同一温湿度环境的抗逆性，芽孢杆菌明显强于乳酸菌、酵母菌，分析原因为，贮存过程中芽孢菌菌粉以芽孢形式存在，这极大地提高了它们的抗逆性。而乳酸菌中乳酸球菌强于乳杆菌，乳杆菌中植物乳杆菌相对较好，且低温更有利于饲料中益生菌活性的保持。

2.2饲料中添加高铜、高锌对益生菌存活的影响由图2可知，60 d贮存周期内（温度10～29℃、平均湿度50%左右），4株益生菌与高浓度铜、锌贮存过程中活菌数变化差别较大。对于菌株C1-0155、C2-0026，4种处理间活菌数均无显著性差异，表明枯草芽孢杆菌C1-0155及戊糖片球菌C2-0026对高铜、高锌的抗逆性强。对于菌株C2-0038、C4-0021，分别在贮存19、30 d后菌株的Cu、Zn、Mix组活菌数均明显低于CK组（P＜0.05），分析原因为高铜、高锌对这2株菌有较强的毒害作用，致使其活菌损失严重。这表明，鼠李糖乳杆菌C2-0038及产朊假丝酵母C4-0021对高铜、高锌的抗逆性均较差。

图2　4株益生菌在高浓度铜、锌饲料中活菌数变化

表1列出了其他益生菌在贮存60 d后各组别的活菌数（lg cfu/g）。对于枯草芽孢杆菌C1-0085及植物乳杆菌C2-0001，4种处理间活菌数均无显著性差异，表明这2株菌对高铜、高锌的抗逆性强。对于干酪乳杆菌C2-0003，其Cu、Mix组活菌数与CK组差异显著，但Zn组与CK组差异不显著，表明这株菌耐受高锌但不耐受高铜。对于海洋红酵母C4-0016及酿酒酵母C4-0032，其Cu、Zn、Mix组活菌数均与CK组差异显著，表明这2株酵母菌对高铜、高锌的抗逆性都较差。

表1　益生菌贮存60 d后组别间活菌数差异性分析lg cfu/g

2.3益生菌对铜、锌的最大耐受浓度以带毒平板法测定试验所用益生菌对铜、锌的最大耐受浓度，结果见表2。结果显示，不同菌株对Cu2+、Zn2+耐受浓度差异显著。其中，2株芽孢杆菌对Cu2+、Zn2+敏感性都很强，耐受浓度最低。其他菌株对Cu2+最大耐受浓度从高到低为：植物乳杆菌C2-0001、产朊假丝酵母C4-0021、植物乳杆菌C2-0015、戊糖片球菌C2-0026、海洋红酵母C4-0016、酿酒酵母C4-0032、干酪乳杆菌C2-0003、鼠李糖乳杆菌C2-0038。而菌株对Zn2+最大耐受浓度显示，4株乳酸菌明显高于3株酵母菌。

夏彬彬（2008）以液体共培养法测定的啤酒酵母的最大Zn2+耐受浓度为300 mg/L，而本试验所用酿酒酵母的最大Zn2+耐受浓度为700 mg/L。夏彬彬（2008）测定的胶质芽孢杆菌最大Zn2+耐受浓度在100～110 mg/L。张花香（2005）以液体共培养法测定的蜡样芽孢杆菌对Cu2+的最大耐受浓度仅有0.10 mg/L，对Zn2+最大耐受浓度为0.05 mg/L。而本研究中所用枯草芽孢杆菌C1-0085及C1-0155的最大Cu2+耐受浓度为40 mg/L，最大Zn2+耐受浓度为100 mg/L。

表2　益生菌菌株对铜、锌最大耐受浓度测定结果mg/L

3　结论

本试验中9株益生菌对同一温湿度环境的抗逆性不同，2株芽孢杆菌的抗逆性强于乳酸菌及酵母菌，且低温更有利于饲料中益生菌活性的贮存。在饲料贮存过程中，各益生菌对高铜（200 mg/kg）、高锌（2500 mg/kg）的耐受程度存在很大差异。2株芽孢杆菌对高铜、高锌的耐受性都很强，乳酸菌耐受性较差，但乳球菌C2-0026相对较好，乳杆菌中植物乳杆菌C2-0001耐受性相对较好，海洋红酵母C4-0016、产朊假丝酵母C4-0021及酿酒酵母C4-0032对高铜、高锌的耐受性都较差。并以带毒平板法测定了所选9株益生菌对铜、锌的最大耐受浓度。芽孢杆菌C1-0085、C1-0155、戊糖片球菌C2-0026、植物乳杆菌C2-0001为本试验最终筛选出的抗逆性强、耐受高铜高锌能力强的益生菌菌株，可广泛应用到动物微生态制剂研发中。

[1]黄建国，刘全.铜锌微量元素添加剂概述[J].饲料博览：技术版，2007，9：51～54.

[2]刘来停，蔡风英，周薇.微量元素对饲料中益生素活性的影响[J].粮食与饲料工业，2001，4：23～24.

[3]夏彬彬，仲崇斌，魏德州，等.胶质芽孢杆菌对Zn2+，Cd2+的生物吸附[J].生物技术，2008，18（3）：80～84.

[4]张花香，宋金秋，吴莎莉.蜡样芽孢杆菌对重金属离子的耐受性及其芽孢吸附能力的研究[J].华中师范大学研究生学报，2005，12（4）：134～137.

[5]Hill G M，Cromwell G L，Crenshaw T D，et al.Growth promotion effects and plasma changes from feeding high dietary concentrations of zinc and copper to weanling pigs（regional study）[J].Journal of animal science，2000，78（4）：1010～1016.

[6]Veum T L，Carlson M S，Wu C W，et al.Copper proteinate in weanling pig diets for enhancing growth performance and reducing fecal copper excretion compared with copper sulfate[J].Journal of animal science，2004，82（4）：1062～1070.■

The experiment was conducted to study the effects of feed storing process and high level of copper and zinc on activity of nine strains of probiotics，to screen the high active probiotics and to determine strains maximum concentration of copper and zinc.Nine strains of probiotics were fermented and made into mono-cultures respectively.Then they were mixed in blank，high level of copper and high level of zinc piglet feed and stored for sixty days respectively.The results showed that the two strains of Bacillus always maintained viable count both in the feed storing process or containing high copper and zinc feed.On the contrary，the tolerance of three strains of yeast to high level of copper and zinc was poor.Besides，for four strains of Lactic acid bacteria，the number of living bacterium had different degree reduce in the feed storing process，and they had different tolerance to high copper and zinc.Pediococcus pentosaceus and plant Lactobacillus had stronger resistance to high level of copper and zinc compared with Lactobacillus casei and Lactobacillus rhamnose，but their activities were lower than those of Bacillus.

probiotics；storage；high level of copper；high level of zinc；activity

S816.7

A

1004-3314（2016）19-0026-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161907