利用DNA条形码与形态学相结合快速鉴定哈麦筛下物

2016-12-04甘肃出入境检验检疫局兰州730010

种子 2016年11期

，，，， (甘肃出入境检验检疫局，兰州 730010)

·种子检验·

尤佳，黄玺，王溪桥，王军平，文朝慧
(甘肃出入境检验检疫局，兰州 730010)

对哈麦筛下物中3种难辨认的杂草种子DNA条形码基因atp-F/atp-H和psbK/psbI进行PCR扩增并对PCR扩增产物测序，以近缘种植物为外类群建立系统进化树构建系统发育树鉴定到属，辅以形态学方法最终鉴定为反枝苋(Amaranthusretroflexus)、千穗谷(Amaranthushypochondriacus)、欧洲油菜(Brassicanapus)。DNA条形码与传统形态学鉴定相结合，弥补了单一鉴定方法的局限性，提高了检测的准确性与时效性。

哈萨克斯坦小麦；杂草； DNA条形码

近年来，随着国际贸易往来增长，进境种子粮谷携带入侵我国的杂草呈现数量增多、频率加强、蔓延范围扩大的趋势。2016年一季度质检总局植物疫情截获通报显示，杂草截获种次占比均为第一，共截获有害生物93 781种次，其中检疫性有害生物达12 772种次。杂草不仅直接危害农田、果、桑、林园各种作物，造成减产，使品质变劣，而且传播病虫害，诱发作物致病[1]。

目前，在出入境检验检疫工作中，杂草鉴定以传统的形态鉴定为主。然而，形态鉴定具有一定的局限性，进境杂草主要以果实或种子形态出现，通常不具备完整的分类鉴定信息，难以准确鉴定；杂草果实或种子通常随进境粮谷、羊毛或运输工具等途径进入，在此过程中经常发生磨损，导致果实或种子形态特征不完整，进一步加大了鉴定难度；另外，形态学鉴定需要专业人员有丰富的经验，甘肃局杂草分类鉴定研究基础较为薄弱，缺乏相关方面的专家，在一定程度上影响了口岸检验检疫的效率和质量。随着经济一体化趋势以及丝绸经济带甘肃黄金段的建设，会有越来越多的境外植物产品进入甘肃，外来入侵杂草的输入更加直接和频繁，如要在确保检验检疫质量的同时，又能缩短检验检疫周期，加快通关速度，促进外贸健康发展，就必须利用先进的分子生物学技术提高检验检疫效率。DNA条形码技术是利用一段或几段标准的、易扩增的、种间差异显著大于种内差异的 DNA片段来鉴别物种的新技术[2]。该技术有助于发现新物种，并为解决近似种和隐存种等传统分类鉴定难题提供新的研究方法与思路。

1 材料与方法

1.1 材料

哈萨克斯坦小麦筛下物(未知物种杂草)。

1.2 试剂

植物DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；DNA胶回收试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司；引物由华大基因公司合成，用无菌去离子水溶解至终浓度为10μmol/L，-20 ℃保存备用。

1.3 方法

1.3.1 PCR扩增测序

本实验选用2对DNA条形码atp-F(5’-ACTCGCAC ACACTCCCTTTCC-3’)和atp-H(5’-GCTTTTATGGAAGCT TTAACAAT-3’)，psbK(5’-TTAGCCTTTGTTTGGCAAG-3’)和psbI(5’-AGAGTTTGAGAGTAAGCAT-3’)进行PCR扩增，反应程序：94 ℃ 4 min，94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。用1.5%琼脂糖进行PCR产物凝胶电泳，用DNA快速纯化回收试剂盒回收目的片段，送测序。

1.3.2 外类群选择

选择NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)亲缘关系较近的属做外类群，序列调自Genbank。

图1 基于atpf-atph序列构建未知物种及近缘物种部分序列的邻位相连法分子系统树NJ

图2 基于atpf-atph序列的未知物种X 1、X 2及近缘物种部分序列的遗传距离

图3 基于atpf-atph序列构建未知物种及近缘物种部分序列的邻位相连法分子系统树NJ

1.3.3 数据分析

采用BioEdit软件进行校对和排序，然后用MEGA6.0、Clustal X软件进行系统发育分析，采用Neighbor-Joining算法中的Kimura 2-Parameter模型构建系统发育树，自展分析1 000次。

1.3.4 形态鉴定

形态学辅助鉴定确定物种。

2 结果与分析

2.1 外类群物种

根据测序公司反馈结果，结合序列图谱，选择序列质量得分和有效读长最高的测序结果进行NCBI blast，得到系统进化树外类群，序列号见表1。

2.2 系统发育树与遗传距离

通过图1系统发育树可以看出，X1、X2与苋属植物(Amaranthus)聚类在一起，结合遗传距离图2，X1与反枝苋(Amaranthusretroflexus)遗传距离最小(0.005 3)，刺苋(Amaranthusspinosus)其次(0.007 1)；X2与X1遗传距离最近(0.007 1)，反枝苋(Amaranthusretroflexus)次之(0.036 2)。

通过图3系统发育树可看出，X3与芸薹属(Brassica)聚类在一起，结合遗传距离图4，X3与欧洲油菜(Brassicanapus)、芜菁(Brassicarapa)、芥菜(Brassicajuncea)遗传距离最小(0.003 1)，与甘蓝(Brassicaoleracea)较近(0.003 5)，需要形态学辅助鉴定。

2.3 形态学鉴定比对

解剖镜下进行进一步比对(图5)。X1种子近圆形；直径1 mm，厚0.5 mm；黑色，两面凸，呈凸透镜状，表面光滑有强光泽；周边较薄，有细颗粒状环带，因此确认为反枝苋(Amaranthusretroflexus)。X2种子近圆形；直径1.3 mm，厚0.7 mm；红褐色，两面凸，呈凸透镜状，表面光滑有强光泽，具环状边；种脐黑色，明显突出，鉴定为千穗谷(Amaranthushypochondriacus)。X 3种子球形，径长2 mm；种皮深褐色，表面具不规则网纹，网眼浅而小，不甚明显；种脐小，凸起，表面覆盖白色遗留物，鉴定为欧洲油菜(Brassicanapus)。

表1 系统进化树外类群

序号种名编号1Amaranthusspinosus刺苋GQ247902．12Amaranthusretroflexus反枝苋HQ594560．13Betavulgaris甜菜KR230391．14Salicornia(brachiate)海蓬子KJ629115．15Haloxylonammodendron梭梭KF534478．16Haloxylonpersicum白梭梭KF534479．17Chenopodium(simplex)藜HQ594634．18Amaranthushybridus绿穗苋GQ247901．19Brassicanapus欧洲油菜KM454973．110Brassicarapa芜菁DQ231548．111Brassicajuncea芥菜KT581449．112Brassicaoleraceavar．甘蓝KR233156．113Raphanussativus萝卜KJ716483．114Sinapisarvensis白芥HQ594867．115Raphanusraphanistrum野萝卜GQ248045．116VellapseudocytisusGQ248064．117Eutremahalophilum山嵛菜KT962846．1

图4 基于atpf-atph序列的未知物种X 3及近缘物种部分序列的遗传距离

图5 未知物种形态照片

3 讨论

与传统形态学鉴定物种相比，DNA条形码有显著的优势：1) 操作简单，只要会分子生物学操作的人员就可以对未知物种有个大方向的判断，基本可以鉴定到属。2) 大大缩短鉴定周期，一定程度上提高了口岸检验检疫的效率与准确性。3) 不受未知物种生长发育阶段和形态特征的限制。但是，遗传距离相近物种仅通过DNA条形码技术是不能准确鉴定的，主要原因：1) 植物非常容易发生自交、杂交或网状式进化，同一基因在不同植物类群中进化速率不一致，导致植物DNA条形码要比动物DNA条形码研究复杂得多，因此对于植物DNA条形码来讲，该技术还只是一个验证过程，并未完全成熟[3]。2) 常用的植物DNA条形码片段或多或少都存在一定局限性。条形码扩增片段通常较短，就极容易出现重复序列/poly结构，重复序列导致PCR测序反应酶产生滑动，产生非特异性信号。例如该实验所用的叶绿体psbK-psbI序列，在很多论文中都证明可以作为鉴定物种的DNA条形码[4-6]，但是在本实验扩增苋属和芸薹属植物种子DNA时，该条形码扩增片段存在poly-A，序列质量得分很低。其它常用条形码，例如trnH-psbA在很多属植物中扩增成功率和物种识别率方面表现很好[7-8]，但不足的是，该片段存在插入/缺失现象，致使不同植物间该片段长度变异较大，导致非同属物种间的比对较为困难[3]。因此从实用性和准确率等角度考虑，以2～3个条形码组合为宜。3) 受限于Genebank数据库，因此必须与传统分类鉴定相结合才能下结论。

单一通过分子生物学手段鉴定物种，是很难鉴定到种及种下分类阶元的，而且一定程度上也取决于序列的选取。实验通过多条基因序列特征比较，构建系统发育树，利用软件得出与近缘种的遗传距离，快速将未知物种锁定在属的范围，再通过形态分类鉴定佐以补充，确定到种的水平。2种方法相结合一定程度上弥补了甘肃口岸植物分类鉴定经验的不足，同时提高了口岸截获外来物种的鉴定准确性与时效性。

[1]李慧.常见杂草识别与防除原色图谱[M].北京:中国农业出版社,2009.

[2]付涛,王志龙,钱萍仙,等.高等植物DNA条形码最新研究进展及其应用[J].核农学报,2016(5):887-896.

[3]伏建国,杨晓军,钱路,等.植物DNA条形码技术在出入境检验检疫领域的应用[J].植物检疫,2012,26(2):64-69.

[4]徐晗,孙旻旻,吴品珊,等.DNA条形码、形态学与地理分布相结合的植物果实(种子) 鉴定方法-以口岸截获的外来入侵植物犬蔷薇(RosacaninaL.)为例[J].杂草科学,2015,33(2):26-31.

[5]姚辉,杨培,周红,等.基于叶绿体psbK-psbI序列的石斛属药用植物鉴定[J].药学学报,2015,50(6):783-787.

[6]王培培.DNA条形码在不同地理分布的云杉属物种中的应用初探[D].成都理工大学,2010.

[7]全妙华,欧立军,佘朝文,等.中国石蒜属种间关系的trnH-psbA序列分析[J].园艺学报,2011,38(8):1 589-1 594.

[8]胡文舜,蒋际谋,黄爱萍,等.2种枇杷属植物的trnH-psbA条形码序列变异及其近缘属系统发育初步研究[J].热带作物学报,2014,35(1):12-16.

(本栏目责任编辑：申晓)

The Rapid Identification of Unknown Weed Seeds in Kazakhstan Wheats with DNA Barcoding and Traditional Morphological Identification

YOUJia,HUANGXi,WANGXiqiao,WANGJunping,WENChaohui

2016-07-07