36份小麦种质资源抗麦长管蚜遗传多样性的鉴定与分析

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36份小麦种质资源抗麦长管蚜遗传多样性的鉴定与分析

孔欣欣，王春平，王黎明，董普辉，庞玉辉，张鹏飞
(河南科技大学农学院， 河南 洛阳 471003)

为筛选抗麦长管蚜优异的小麦种质资源，以36份不同抗蚜水平的小麦种质资源为材料，调查记录不同时期供试材料的蚜虫数量，并利用3对位于7 D染色体的特异性简单重复序列(Simple Sequence Repeats，SSR)标记检测材料，采用蚜量比值、Shannon’s 信息指数及聚类分析的方法进行分析，在分子水平上探讨小麦抗麦长管蚜种质资源的遗传多样性。分子检测结果表明，引物Xgwm44、Xwmc182和Xwmc121扩增条带数平均为6.7条，其中多态性条带数分别为5条、5条和2条；平均位点的有效等位基因数范围为0.119 5～1.080 0，Shannon’s信息指数范围0.000 0～1.329 7。聚类分析结果表明，36份小麦种质资源按照阈值λ=2.06可分为4大类群，其中发现抗性品种矮抗58与其它品种具有较远的亲缘关系，可作为最新的抗蚜材料。

小麦； 种质资源； 麦长管蚜； 遗传多样性； SSR分析

小麦是世界上重要的粮食作物之一，麦长管蚜是危害小麦的主要害虫，且是各麦区小麦穗期(受害最敏感期)的优势麦蚜种群[1]。小麦每年产量因病虫为害损失20%左右，其中麦蚜损害为10%～15%[2]。目前，化学抗虫是最常用的防治麦蚜方法，大面积的使用化学农药会杀害蚜虫的早期天敌[3]。因此，培育、筛选和利用抗蚜品种是防治麦蚜最经济有效的措施，同时也最有利于天敌和环境的保护[4-5]。

近年来，国内外许多学者对小麦种质资源及其抗蚜性的遗传差异和进化做了相关研究。Peng等[6]用51对SSR引物对71份小麦品种进行遗传多样性分析，得出SSR标记的平均等位变异位点为6.7个。倪中福等[7]用23个SSR引物对不同生态区的6个春小麦品种(系)及北方冬麦区的17个冬小麦品种(系)进行了遗传多样性分析，获得平均变异位点为2.9个。仇松英等[8]利用18对SSR引物对47份麦蚜抗性不同的小麦品种进行了遗传多样性分析，平均变异位点有5.2个。王春平等[9]选用32对多态性稳定的SSR标记对14份麦长管蚜抗性不同的小麦品种进行了遗传多样性分析，平均等位变异为6.8个。史忠良等[10]利用19对多态性SSR标记分析47份抗麦红吸浆虫品种(系)的遗传多样性分析，平均变异位点为5.47个。许兰杰等[11]利用54对多态性的SSR引物对43份不同抗蚜水平小麦品种(系)进行遗传多样性分析，获得平均等位变异为6.7个。

前人应用SSR分子标记研究了小麦品种抗蚜性的遗传多样性[5,12-14]，但对于小麦种质资源抗麦长管蚜的表型和基因型一致性以及分子标记开发的相互验证在国内外尚未见报道。因此，本研究以36份不同抗蚜水平的小麦种质资源为材料，调查记录不同时期供试材料的蚜虫数量，并利用3对位于7 D染色体的特异性简单重复序列(Simple Sequence Repeats，SSR)标记检测材料，采用蚜量比值、Shannon’s信息指数及聚类分析的方法进行分析，在分子水平上探讨小麦抗麦长管蚜种质资源的遗传多样性，以期明确小麦抗蚜种质资源的遗传多样性、亲缘关系以及标记的应用功效，为小麦抗虫育种的应用提供亲本材料和分子水平上的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

36份小麦种质资源(见表1)：从本课题组前期研究的小麦种子资源中，选择性状稳定的88份供试材料进行田间抗蚜鉴定，根据2年重复资料结果，从中又选择具有不同抗性且抗性结果较为稳定的36份材料作为研究对象。试验材料由河南科技大学农学院小麦遗传育种课题组提供，分别于2012—2013年度和2013—2014年度种植在河南科技大学试验田，完全随机设计，每份供试材料播种2行，行长为1 m，行距为0.24 m，重复3次，保护行种植千斤早作为对照，常规大田管理，整个生育期均不喷洒农药。

表1 36份小麦种质资源抗麦长管蚜鉴定

小麦种质资源蚜情指数抗性级别小麦种质资源蚜情指数抗性级别小麦种质资源蚜情指数抗性级别烟农190．5311MR大唐9910．3885HR千斤早2．1801HS陕糯1号0．3713MR石新7330．6786LR邯61720．7253LR中33990．327MR周麦190．2213HR豫麦491．1286LSAMIGO0．6712LRASTRON0．627LR186TM0．5458MR长武6130．2852HR周麦180．5458MR中8891．2079LS9631．1605LS小偃220．3467MR济麦170．4327MR植952400．4745MR98⁃10⁃350．5655MR远丰1390．9319LSZB070．4131MR荔高6号0．4844MR04⁃F6⁃8160．7794LR豫麦700．772LRPI2626600．895LRPI2949940．5311MRPI高0．627LR小偃2160．3073MR陕5340．8851LR东旱1号0．8286LR周优190．7888LR远丰1752．3186HS矮抗580．1746HR周911770．8433LRZB0111．2638MS

注：HR、MR、LR、LS、MS、HS分别表示对麦长管蚜虫表现为高抗、中抗、低抗、低感、中感和高感。

1.2 抗蚜性鉴定方法

抗蚜性鉴定方法参考曹如槐[15]的蚜情指数法，稍有改动：采用田间自然感蚜，在灌浆成熟期按“Z”字型随机选取10株小麦，调查记录每株主茎麦长管蚜数，隔7 d调查1次，共调查5次。参照Painter[16]分级标准，以蚜情指数作为抗性评价的指标，抗性程度分为7级：免疫、高抗、中抗、低抗、低感、中感、高感，蚜情指数分别为0.00、0.01～0.30、0.31～0.60、0.61～090、0.91～1.20、1.21～1.50、gt;1.50。

1.3 SSR标记分析

取幼嫩叶片用十六烷基三甲基溴化铵法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，CTAB)法[17]提取小麦种质资源的DNA。本研究利用前期[9,18]选取的位于小麦A、B和D组同源染色体组上的175对SSR分子标记进行了全基因组的筛选，鉴定出了有多态性的32对引物，筛选出3对特异性SSR标记。3对SSR标记序列参照Rder等[19]和Somers等[20]研究和相关网站SSR引物的序列信息，由Invitrogen生物工程公司合成。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)反应体系50μL：10×Buffer(含Mg2+)，2 UTaqDNA聚合酶，200μmol/L dNTPs，引物0.4 mol/L，50 ng模板DNA，体积用超纯水补足。选用PTC-200 PCR仪：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)电泳分离PCR产物，银染显色后观察并拍照。

1.4 统计方法

SSR标记检测结果采用0/1赋值法，在相同的迁移位置上有扩增条带，有带记为1，无带记为0，构建0，1二元数据矩阵。利用Excel计算蚜情指数；利用Popgene 1.32[21]软件包计算Shannon’s信息指数和平均位点有效等位基因数；利用DPS 7.05(Data Processing System)版软件计算相似系数遗传距离进行聚类分析。计算公式如下：

2 结果分析

2.1 36份小麦种质资源抗性鉴定分析

在前期大面积筛选抗蚜种质资源的基础上，采用自然感蚜的方法，对多年稳定的88份供试材料进行抗性鉴定，并从中又选择具有不同抗性且抗性结果较为稳定的36份材料作为研究对象，详细结果见表1。由表1可知，36份小麦种质资源中，表现高抗(HR)的材料有3份，包括矮抗58、周麦19、长武613；中抗(MR)材料有14份；低抗(LR)材料有12份；低感(LS)材料有3份；高感(HS)材料有2份。

表3 36份小麦种质资源抗麦长管蚜性的遗传多样性水平

小麦种质资源AeⅠ小麦种质资源AeⅠ小麦种质资源AeⅠ千斤早0．12800．0838PI2949940．11950．0393远丰1390．13940．1567陕糯1号0．26670．2310PI2626600．11950．0393中8890．30000．3662中33990．16670．0000豫麦490．48000．3662大唐9910．22500．4945ZB0110．19420．4500石新7330．27550．1797周优190．24320．1283小偃220．18620．0393ASTRON0．11950．0393周911770．13040．0838ZB070．13040．0838荔高6号1．08000．6365济麦170．65750．5973AMIGO0．19100．4107周麦191．08000．636504⁃F6⁃8160．27550．1797东旱1号0．27550．1797矮抗581．02801．3297烟农190．49940．5459植952400．14060．1283中186TM0．11950．0393邯61720．31990．7324长武6130．74190．522998⁃10⁃350．13040．0838远丰1750．20000．4500PI高0．13040．0838陕5340．12800．0838周麦181．08000．6365中9630．44710．4107小偃2160．75000．1352豫麦700．60000．5014

注:Ae表示平均每位点有效等位基因数;I表示Shannon’s信息指数。

注：1～36编号同表;M:DNA标准分子量；R：抗性种质条带；S：敏感种质条带。图1 Xwmc182标记对36份小麦种质资源的SSR检测结果

2.2 SSR标记的多态性分析

从本课题前期研究[9]所得出的32对引物中，筛选出了3对位于7D染色体上条带清晰、重复性较好的特异性引物Xgwm44、Xwmc182和Xwmc121，对筛选出的36份具有不同抗性的小麦种质资源进行检测，详细结果见表2。由表2可知，Xgwm44、Xwmc182和Xwmc121标记的扩增条带数分别是8条、9条和3条，其中多态性条带数分别为5条、5条和2条，平均每条引物能扩增出条带数6.7条，多态位点百分率为55.7%～66.7%。其中，图1为Xwmc182标记扩增的SSR产物电泳图，其带型分布与小麦种质资源抗性鉴定结果一致。

表2 SSR标记检测结果的多态性分析

代号标记扩增条带数多态性条带数(%)多态位点百分率(%)1Xgwm448562．52Xwmc1829555．73Xwmc1213266．7

2.3 36份小麦种质资源抗蚜性的遗传多样性分析

采用0/1赋值法对SSR标记检测结果构建0，1二元数据矩阵，利用软件包计算Shannon’s信息指数和平均位点有效等位基因数，详细结果见表3。由表3可知，36份不同抗性水平的小麦种质资源中，平均位点的有效等位基因数的范围为0.119 5～1.080 0，Shannon’s信息指数的范围为0.000 0～1.329 7。说明36份小麦种质资源抗麦长管蚜的遗传多样性相对丰富。其中，矮抗58的遗传多样性最高，Ae值和I值分别为1.028 0、1.329 7；周麦19、荔高6号、周麦18次之，Ae值和Ⅰ值分别均为1.080 0、0.636 5；中3399最低，Ae值和Ⅰ值分别为0.166 7、0.000 0。36份小麦种质资源的平均位点有效等位基因数为0.363 9，Shannon’s信息指数为0.308 5。SSR标记结果反映了36份小麦种质资源抗性遗传变异的程度，说明36份小麦种质资源抗麦长管蚜的遗传多样性很丰富。

2.4 小麦种质资源抗蚜性的聚类分析

根据SSR标记的数据结果，计算出36份小麦种质资源的遗传相似性系数矩阵，结合UPGMA法构建种质资源间的聚类分析图(图2)。按照阈值为标准，36份小麦种质资源可分为4大类。第1类包括千斤早、石新733、远丰139、ZB011、899、963、豫麦49、远丰175；第2类包括陕糯1号、周优19、3399、小偃22、ZB 07、PI高、98-10-35、周91177、PI 294994、186 TM、PI 262660、ASTRON、东旱1号、04-F 6-816、植95240、陕534、AMIGO、大唐991、邯6172、济麦17、烟农19、豫麦70；第3类包括小偃216、长武613、周麦18、荔高6号、周麦19；第4类包括矮抗58。其中，第1类为敏感型的种质资源，第2类包含低抗、中抗型的种质资源，第3类包含中抗、高抗型的种质资源，第4类为高抗型的种质资源。

图2 36份小麦种质资源的聚类分析图

3 讨 论

分析小麦种质资源抗蚜遗传多样性是保护、开发和利用种质资源的前提。目前，SSR分子标记是遗传多样性研究较为有效的方法。本研究是在本课题组[9]前期研究基础上，筛选出的3对位于7 D染色体上条带清晰、重复性好的特异性引物，对36份具有代表性的小麦种质资源进行遗传多样性分析，结果表明，平均每条引物能扩增出条带数为6.7条。研究结果与Peng等[6]抗俄罗斯双尾蚜小麦种质资源微卫星标记分析、许兰杰等[11]不同抗蚜水平小麦品种(系)SSR分析6.7条的结果一致，且与本课题组前期[9]小麦品种SSR分析6.8条的结果几乎一致，验证了SSR标记的重复可用性，为以后本课题开发利用抗蚜功能标记奠定了基础。

对品种进行聚类分析，是研究品种间遗传差异和杂交育种亲本选配的重要参考依据。从当前抗蚜育种的形势来看，了解抗蚜品种间的遗传差异对于抗蚜品种的选育具有重要意义。本研究以相对距离为2.06时将36个具有不同抗性的材料聚为4大类群。聚类结果与Peng等[8]、王春平[9]、许兰杰等[11]的结果不一致，这与研究材料的不同、所用检测标记的类型及抗蚜机制的不一致有关；试验材料为36份具有不同抗性的小麦种质资源，聚类结果为4大类是可行的，这些材料的表型和基因型结果基本一致，其中表型为低抗型的石新733被聚类到敏感型的种质资源中，匹配率为97.2%，分析结果可靠，可作为分子标记辅助育种中抗虫育种的亲本材料。

4 结 论

本研究利用3对SSR标记对36份小麦种质资源进行检测，采用蚜量比值、Shannon’s信息指数及聚类分析的方法进行分析，得出的主要结论如下：

1) 36份小麦种质资源中，表现高抗(HR)的材料有3份，包括矮抗58、周麦19、长武613；中抗(MR)材料有14份；低抗(LR)材料有12份；低感(LS)材料有3份；高感(HS)材料有2份。

2) 引物Xgwm44、Xwmc182和Xwmc121扩增的条带数分别是8条、9条和3条，其中多态性条带数分别为5条、5条和2条，平均每条引物能扩增出条带数6.7条，多态位点百分率为55.7%～66.7%。

3) 36份小麦种质资源抗麦长管蚜的遗传多样性相对丰富，平均位点的有效等位基因数的范围为0.119 5～1.080 0，Shannon’s信息指数的范围为0.000 0～1.329 7。

4) 36份小麦种质资源可分为4大类。其中，第1类占8份，属于敏感型的种质资源；第2类占22份，属于抗型的种质资源；第3类占5份，属于中高抗型的种质资源；第4类仅一份(矮抗58)，属于高抗型的种质资源。

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Identification and Analysis of Genetic Diversity of Resistant to Sitobion Avenae of 36 Wheat Germplasm

KONGXinxin,WANGChunping,WANGLiming,DONGPuhui,PANGYuhui,ZHANGPengfei

2016-06-19

人才基金(编号：09001595);国家自然基金(编号：U 1304320和U 1304318)。

孔欣欣(1991—)，女，硕士研究生，主要从事小麦遗传育种；E-mail：434379563@qq.com。

王春平(1969—)，女，硕士生导师，主要从事小麦遗传育种和种子工程的研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.062

S 512.1

A

1001-4705(2016)11-0062-05