东寨港河口牡蛎中重金属-抗生素抗性细菌分析

崔丁心，陈 玲，陈 慧，阮 静，谢秀祯

（海南师范大学 生命科学学院，海南 海口 571158）

东寨港河口牡蛎中重金属-抗生素抗性细菌分析

崔丁心，陈 玲，陈 慧，阮 静，谢秀祯*

（海南师范大学 生命科学学院，海南 海口 571158）

为检测野生牡蛎肉中是否存在抗性细菌，从东寨港河口采集牡蛎样品，利用含有Cu2+（a）、As2+（b）、Zn2+（c）、Cd2+（d）的单一重金属离子或抗生素（诺氟沙星（N）、磺胺二甲嘧啶（B）、红霉素（S）、杆菌肽锌（E））的单抗选择培养基以及它们交叉组合的双抗选择培养基进行培养，共分离到25株抗性细菌，其中革兰氏阴性细菌占64%，有色菌占56%.在pH6.8的选择培养基上分离到的6.8Cu2菌株可在12种双抗培养基（dN、cN、aN、bN、dB、bB、aB、cS、bS、aS、cE、bE）上生长，是交叉抗性最多的菌株.本研究结果为制定水产养殖规范和水产品风险评估提供依据.

重金属抗性；抗生素抗性；交叉抗性；牡蛎

长期以来，养猪业滥用抗生素已经造成了环境的抗生素污染，并导致超级抗生素抗性微生物的出现.这些抗生素抗性微生物通过食物链转移将给人类带来公共卫生风险.近十年来，宋林生[1]、朱永官[2]、张干以及周启星[3]等研究团队分别针对海洋养殖、养猪场土壤、典型区域环境中抗生素抗性基因污染开展了相关研究.高盼盼等[4]对抗生素抗性基因在水产养殖业中的来源、污染现状、潜在的传播途径和相关的检测方法进行了分析和介绍.邹世春等人[5]也开展了珠三角一些主要水体（河流、养殖基塘、污水处理厂及海湾等）中抗生素及北江河水中磺胺抗性基因污染的研究.结果发现，所选择的3类共9种抗生素均可普遍检出，且含量惊人.特别值得注意的是，2013年2月PNAS上发表一篇来自中美联合研究团队研究中国3个年出栏一万头以上的大型规模化养猪场抗生素抗性基因.共检测到149种抗生素抗性基因，其中，有63种基因的抗药浓度比原始森林的土壤检出量高出上百倍，甚至有的超过近3万倍[6].

铜、锌和有机砷制剂的超量添加，在饲料业较为普遍.与抗生素及其他有机污染物不同，重金属污染具有隐蔽性、长期性和不可逆性，加上其可富集性和累积性，其潜在危害不容忽视.长期施用规模养殖场

猪粪的土壤及蔬菜中铜、锌、砷含量均显著高于对照组（p＜0.05)，对照组中则未检出[7].大量研究表明，细菌的重金属抗性及抗生素抗性之间存在抗性关联，环境重金属污染对抗生素抗性的维持和扩散可能起非常重要的作用，人为重金属的滥用会起到保持抗生素抗性基因库的作用[8].对环境敏感的微生物可通过环境选择驯化形成重金属和抗生素协同抗性.例如，从在渔业养殖场中分离到的假单胞菌属和气单胞菌属的细菌，对多种重金属和抗生素具有抗性[9-10]，在广东某大型养猪场也筛选出多个双抗菌株[11]，这说明了对环境选择最为敏感的微生物能够通过自身的进化（包括改变自身的形态结构、生理代谢和遗传物质等途径）和发展形成抗生素和重金属离子交叉抗性，从而能够在交叉污染的环境中生长.当这些携带抗重金属和抗抗生素基因的双抗细菌在环境中进行传播，对生态环境安全将造成威胁.质粒常常带有抗性基因，通过转化、质粒消除和质粒测序方法已经证明重金属和抗生素抗性基因常常定位于质粒上[12-14].如果抗性基因通过可移动元件质粒整合到“超级细菌”中，将对人类的健康造成巨大威胁.最令人担忧的是环境中很多同时抗多种重金属和多耐药性菌株是常见的致病菌，如医院分离到的伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）[15]，洋葱伯氏菌（Burkholderia cepacia）[16]等.因此，此类微生物的大量出现，很可能成为危害公众健康的因素之一，需要引起人们的高度重视.

海南东寨港国家自然保护区是我国建立的第一个以保护红树林生态系统为主的国家级自然保护区，其核心区正好位于演丰东河和演丰西河的入海口.上世纪80年代之后的二十余年来，罗牛山农场及其周边的大型养猪场污水通过演丰东河持续排放，对保护区的生态安全造成了严重影响.经过近几年的积极治理及对其周边的养殖场进行整顿，污染态势已得到有效控制，但河口海洋生物受到抗生素和重金属的长期污染后，其体内是否已经出现抗性细菌，这些抗性细菌的交叉抗性种类多少，至今尚未见报道.本实验以东寨港河口牡蛎为研究对象，通过培养分离其体内的抗性细菌，实验结果可为公共卫生风险管理提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

用海水初步清洗外壳，装入保鲜袋后放入有冰袋的泡沫箱中.采集的样品当天运回实验室.

1.2 培养基配制

1）试验培养基：NaCl 50g、MgCl25.9g、Na2SO43.2g、CaCl21.9g、蛋白胨5g、酵母膏1g、琼脂20g、复合盐A液20 mL、复合盐B液1 mL、蒸馏水1000 mL.上述培养基分别按pH6.8、7.0、7.5进行配制.

复合盐A液：Na2CO30.8g、柠檬酸铁0.5g、KCl 2.75g、蒸馏水100 mL.

复合盐B液：SrCl23.4g、KBr 8.0g、H3BO32.2g、Na2SiO30.4g、（NH4）2SO40.16g、Na2HPO40.8g、蒸馏水100 mL.

2）单抗选择培养基：将试验培养基灭菌后冷却至60℃左右，然后分别向100 mL试验培养基中加入100μL的CuCl2、NaAsO2、ZnSO4·7H2O、CdSO4·8H2O贮存液，终浓度分别为0.5 mmol/L、2 mmol/L、1 mmol/ L、25 mg/L；或加入诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶、红霉素、杆菌肽锌贮存液，终浓度分别为267μg/mL、280μg/mL、50μg/mL、32μg/mL.

3）双抗选择培养基：将4种抗生素和4种重金属两两组合共16种分别加入到冷却至60℃左右的试验培养基中，摇匀后倒平板，交叉组合种类见表1.

表1 重金属和抗生素的交叉组合Tab.1 Cross combination of heavy metals and antibiotics

1.3 试验方法

1.3.1 菌悬液制备

将采集的牡蛎样品用无菌水冲洗干净后移至超净工作台，用棉球蘸取75%酒精溶液对其进行表面消毒后打开牡蛎，用无菌剪刀取出牡蛎肉并剪碎，称取10g置于装有90 mL 3.4%NaCl的无菌溶液和玻璃珠的三角瓶中，于15℃、150 r/min振摇30 min.牡蛎肉悬液过滤得到10-1菌液样品；用移液管吸取10-1

样品1 mL至灭菌后加入了9 mL无菌水的10 mL试管中，溶液混匀，该样品视为10-2；以此类推，梯度稀释至10-5浓度稀释样品.

1.3.2 抗性菌筛选

取10-4、10-5稀释度的菌悬液200μL分别涂布在单抗选择培养基和双抗选择培养基上，每个抗性平板做3个平行，28℃培养3-7d后观察平板上是否长出相应抗性菌株.对长出的菌株进行划线培养后进行革兰氏染色及镜检，继续进行交叉抗性实验.

1.3.3 交叉抗性试验

将筛选到的抗性菌分别通过划线接种到16种双抗平板上，观察抗性菌是否能够在其它抗性平板生长，并记录抗性结果.

2 结果与分析

2.1 抗性菌的菌落特征及革兰氏染色

利用选择培养基共筛选出25株抗性菌，以菌株生长的培养基的pH值加上筛选出该菌的抗性平板的种类为该抗性菌的名称，菌落特征见表2.菌株革兰氏染色镜检图片见图1.由图1可知，25株抗性菌中有16株革兰氏阴性菌、9株革兰氏阳性菌，G-菌占64%；6.8Cu2为四联球菌，革兰氏染色结果为革兰氏阳性细菌.另外，有色菌株14株，占56%.有研究结果显示，细菌的抗性强度与菌落颜色呈正相关，菌落呈现出的颜色越明显相应细菌的抗性强度就越强[14].

表2 抗性菌菌落特征Tab.2 Colonial morphology of resistant bacteria

2.2 交叉抗性情况

由表3可见，除7.5Zn没有交叉抗性以外，其它菌株均有不同的重金属和抗生素交叉抗性.6.8Cu2能在12种交叉抗性板上生长，是交叉抗性最多的菌；6.8Nor-Zn、7T-Cd、7.5Cu只能在一种交叉抗性平板上生长；6.8Zn、7Sul、7Nor-Cu、7.5Nor-Cd能在3种交叉抗性平板上生长；6.8Sul-Cd、6.8Nor-Cd、7Cu、7.5T-Cd、7.5Sul-Zn能在4种抗性平板上生长；

6.8Cu1能在5种抗性平板上生长；7T-As、7.5Sul-Cu能在6种抗性平板上生长；7ETM、7As-ETM、7.5Sul能在7种抗性平板上生长；7.5ETM-Zn能在8种抗性平板上生长；6.8Nor、7Nor-Zn、7.5ETM能在9种抗性平板上生长；7.5As能在11种抗性平板上生长.李彬辉[11]等人认为在重金属和抗生素复合污染环境中，对环境选择最为敏感的微生物能够通过自身的微进化（包括改变自身的形态结构、生理代谢和遗传物质等途径）形成抗生素和重金属离子的交叉抗性.谢丽金[17]从罗牛山农场周边养猪废水中也筛选到重金属-抗生素双抗菌，并发现环境中的重金属能在一定程度上激发细菌的其他交叉抗性，即由于重金属的存在，菌种在具有抗生素抗性的基础上又产生了多种交叉抗性，推测重金属是交叉抗性产生原因的重要因素之一.本实验的样品来自东寨港河口，它是演丰东河的入海口，其上游的罗牛山农场及其周边的大型养猪场持续20多年的废水排放，使得该河口成为复合污染的一个典型环境，其污染物正是养猪饲料中添加的抗生素和Cu、As、Zn等重金属.本实验结果反映出在抗生素和重金属微污染环境中，微生物已经通过自身的微进化产生了对抗生素和重金属的交叉抗性.

图1 抗性菌镜检图片(×100)Fig.1 Photomicrograph of the resistant bacteria(×100)

表3 菌株的交叉抗性结果Tab.3 Cross-resistance of the bacteria

3 结论

从东寨港河口牡蛎肉中共分离到25株抗性菌，包含重金属抗性菌7株、抗生素抗性菌5株和重金属-抗生素抗性菌13株，G-菌占64%，除7.5Zn外，不同菌株表现出对不同重金属和抗生素的交叉抗性.其中细菌6.8Cu2能在12种双抗培养基上生长，该菌排列整齐，排列形态与四联球菌相同，菌落呈黄色，是交叉抗性种类最多的菌.另外，有色菌株14株，占56%，本实验将继续对所有菌株的抗性强度进行分析.

牡蛎只是东寨港河口生态的一部分，并不能准确反映出东寨港河口水域中抗性基因的污染程度，但通过本实验应当充分意识到抗性基因可能带来的生态安全风险及食品安全风险.

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责任编辑：刘 红

Analysis of Resistant Bacteria of Antibiotic and Heavy Metal in Oysters from Dongzhaigang Estuary

CUI Dingxin，CHEN Lin，CHEN Hui，RUAN Jing，XIE Xiuzhen*
（School of Life Science，Hainan Normal University，Haikou 571158，China）

In order to detect whether resistant strains exist in the meat of wild oysters subsisted on Dongzhaigang estuary, we collect samples and cultivate the selective mediums containing heavy metals（Cu2+（a）、As2+（b）、Zn2+（c）、Cd2+（d））or antibiotics（Norfloxacin（N）,Sulfadimidine（S）,Erythromycin（E）,Bacitracin zinc（E））and their cross combinations.25 resistant strains are isolated,among which Gram-negative and colored bacteria account for 64%and 56%respectively,and strain 6.8Cu2 is the most resistant one,displaying 12 kinds of cross-resistance（dN、cN、aN、bN、dB、bB、aB、cS、bS、aS、cE、bE）.This result provides a scientific basis for working out good aquaculture practice and the risk assessment of aquatic products.

heavy metal resistance；antibiotic resistance；cross resistance；oysters

Q 93-3

A

1674-4942（2016）03-0263-05

2016-04-27

大学生创新创业计划项目（201411658039）

*通讯作者