超声辅助分散液液微萃取/超高效液相色谱-串联质谱法检测水中多种磺胺类抗生素残留

李晓晶，于 鸿，杨 蓉，甘平胜，刘 苗，黎志峰

(广州市疾病预防控制中心，广东 广州 510440)



超声辅助分散液液微萃取/超高效液相色谱-串联质谱法检测水中多种磺胺类抗生素残留

李晓晶*，于 鸿，杨 蓉，甘平胜，刘 苗，黎志峰

(广州市疾病预防控制中心，广东 广州 510440)

建立了水中13种磺胺类抗生素的超声辅助分散液液微萃取/超高效液相色谱-串联质谱(UA-DLLME/UPLC-MS/MS)测定方法。以乙腈为分散剂，四氯乙烷为萃取剂，通过超声分散方式协同萃取水样中的目标化合物，采用C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)分离，以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，采用UPLC-MS/MS多反应监测模式(MRM)测定。优化了萃取剂和分散剂的类型和用量、萃取时间、氯化钠浓度和pH值等条件。在优化条件下，13种磺胺类抗生素在一定质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.998，方法检出限(S/N=3)为0.6～2.4 ng/L；3个加标水平的平均回收率为80.3%～101.8%，相对标准偏差(RSD，n=5)为0.7%～4.5%。该方法前处理简单、环保、灵敏，适用于水样中多种磺胺类抗生素的测定。

超声辅助分散液液微萃取；超高效液相色谱-串联质谱；磺胺类抗生素；水样

磺胺类药物是应用最广、用量最大的一类广谱抑菌药，主要用于畜牧养殖，预防和治疗细菌感染性疾病。使用后的药物可通过未经处理的农业废水、养殖废水和生活污水的直接排放，以及通过养殖场排放的粪便以填埋、施肥等方式进入到土壤环境中，最后经地表径流与渗滤污染地下水和人类饮用水水源。毒理学研究表明，这些药物可能会引起耐药性，具有潜在的致癌作用，对人类健康和生态环境造成严重危害[1]。目前，磺胺类药物的前处理方法主要采用液液萃取[2-3]、固相萃取[4-6]、微波萃取[7]、固相微萃取[8-9]等。然而这些技术存在操作冗繁、萃取时间长、使用大量有毒溶剂等缺点。将上述萃取技术微型化，建立不用或少用有毒有机溶剂、成本低、操作简单、应用范围广的样品前处理技术检测方法一直是研究者努力的方向。

近些年，分散液液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME)因具有所需萃取溶剂用量小、萃取速度快、萃取效率和富集倍数高、操作简便、消耗低和环境友好等优点，已发展成为一种极具潜力的分离富集技术[10-13]。目前，关于水中磺胺类抗生素的液液微萃取鲜有报道[14-15]，这些报道检测的磺胺种类少且检测方法主要为传统的高效液相色谱法。采用DLLME 并加以超声辅助(Ultrasound-assisted，UA) 对样品进行富集浓缩前处理，加速了不互溶的两相之间的质量传递，可在最小的溶剂使用量和最短的时间内快速提高萃取效率。目前未见将超声辅助液液微萃取(UA-DLLME)技术应用于多种磺胺类抗生素检测的研究。本文采用UA-DLLME技术对水体中13种磺胺类抗生素进行提取，采用高灵敏度、高选择性的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法对其进行测定。该方法快速、高效、环保，可同时进行水样中多种磺胺类抗生素的检测和确证分析。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters Acquity UPLCTMXevoTMTQ-S型超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司，配电喷雾离子源)、自动Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)、TDL-5-A型离心机(上海安亭科技仪器厂)、超声仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)、精密电子天平(德国Sartorius公司)、氮吹仪(美国Organomation公司)。

1.2 标准溶液的配制

1.3 样品前处理

移取5.00 mL水样于10 mL离心管中，加入0.1 g 氯化钠，振荡溶解，将 1.00 mL乙腈(分散剂)和150 μL四氯乙烷(萃取剂)混合液用 1 mL 玻璃注射器迅速注入上述溶液中，形成水/四氯乙烷/乙腈乳浊体系，超声辅助萃取5 min后，以4 000 r/min 离心5 min。弃去上层液体，用微量进样器抽取一定体积沉淀相，氮气吹干，用乙腈-水(2∶8)溶解并定容至0.5 L，进行UPLC-MS/MS分析。

1.4 色谱-质谱条件

色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITYTMUPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；流动相：0.1%甲酸(A)-乙腈(B)；梯度洗脱程序：0～0.5 min，95%A，0.5～7.0 min，95%～5% A，7.0～7.01 min，5%～95%A，7.01～7.5 min，95%A；柱温30 ℃；进样体积10 μL；流速0.4 mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：150 ℃；去溶剂气流量：650 L/h；去溶剂气温度：450 ℃；锥孔反吹气流量：150 L/h；多反应监测(MRM)模式；各磺胺类抗生素的监测离子对(m/z)及锥孔电压、碰撞能量参数见表1。

表1 目标物的串联质谱分析条件

﹡quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 萃取剂的选择

萃取剂的选择对萃取效率以及富集倍数起着重要作用。通常萃取剂的选择需满足：密度比水大；对待测物有较好的萃取效果；在水中溶解度小；能形成稳定的两相系统。本实验选择5种萃取剂(二氯甲烷、四氯化碳、四氯乙烷、四氯乙烯和三氯甲烷) 进行比较，移取磺胺类抗生素混标储备液于5.0 mL水中，制得含磺胺类抗生素的模拟水样。采用100 μL萃取剂和1.0 mL乙腈为分散剂的萃取混合液，按照“1.3”方法进行处理。结果表明：四氯乙烷对绝大部分磺胺类抗生素具有很好的萃取效率，其次是二氯甲烷，而四氯化碳和四氯乙烯的萃取效率较低(见图1)。可能是由于四氯化碳和四氯乙烯属于非极性溶剂，而四氯乙烷和二氯甲烷的极性较大，根据相似相溶原理，磺胺类抗生素属于极性化合物易溶于极性有机溶剂。因此，实验选择四氯乙烷为萃取剂。

图1 不同萃取剂对萃取回收率的影响Fig.1 Effect of various extraction agents on extraction recoveries

2.2 萃取剂体积的选择

分别以含不同体积的四氯乙烷(50，100，120，150，180 μL)和1.0 mL乙腈为萃取混合液，按照“1.3”方法进行萃取，结果表明，磺胺类抗生素的萃取回收率随着四氯乙烷体积的增加而增加，当体积达150 μL时大部分目标物的回收率最大，继续增大四氯乙烷的体积至180 μL，磺胺类抗生素的回收率反而降低。因此，最终选择萃取体积为150 μL。

2.3 分散剂的选择

分散剂的类型也是影响萃取效率的关键因素，通常要求分散剂在萃取溶剂中有良好的溶解性能并能与水互溶，使萃取溶剂在水相中分散成细小的液滴，增大其与待测物的接触面积，从而提高萃取效率。分别考察了甲醇、乙腈和丙酮为萃取剂时的萃取效率。配制一定浓度的含磺胺类抗生素残留的水样，分别采用1.0 mL 上述3种分散剂(均含有150 μL四氯乙烷)按照“1.3”方法进行萃取。结果发现乙腈的萃取效率最高，其次是丙酮，而甲醇的萃取效率最低，最终选择乙腈作为分散剂。

2.4 分散剂体积的影响

分散剂乙腈的体积直接影响“水/乙腈/四氯乙烷乳浊液”体系的形成，并导致萃取剂在水中的分散程度发生改变而影响萃取效率。本实验考察了不同体积(0.5，1.0，1.5，2.0 mL)的乙腈对液液微萃取的影响。结果表明，萃取率先随乙腈体积的增加而增加，在1.0 mL时达到最大值，此后则随乙腈体积的增加而减小。这是因为乙腈体积小时，萃取剂未能均匀分散在水相中，导致萃取效率低。当乙腈体积过大时，待测物在水中的溶解度加大，导致萃取效率降低，因此实验选择乙腈的最佳体积为1.0 mL。

2.5 盐加入量与pH值的影响

在水样中加入氯化钠，可改变水溶液中的离子强度，产生一定的盐析效应，有利于萃取效率的提高。本实验考察了氯化钠的用量分别为0，0.01，0.02，0.04，0.10 g/mL时13种磺胺类抗生素的萃取效率，以5 mL取样量计，则氯化钠的添加量分别为0，0.05，0.10，0.20，0.50 g。结果表明，随着氯化钠加入量的增加，磺胺类抗生素的萃取回收率逐渐提高；当氯化钠添加量为0.10 g(0.02 g/mL)时萃取回收率最大；继续增加氯化钠用量，回收率反而减小。因此实验选择氯化钠的用量为0.02 g/mL。溶液的pH值也会影响磺胺类抗生素的萃取效率，由于磺胺类药物在酸性或碱性的溶液中有较大溶解度，从而导致萃取效率不高，因此本实验选择在中性条件下对其进行萃取。

2.6 超声时间的影响

利用超声对DLLME进行辅助，能够加速不互溶两相之间的质量传递，使得萃取效率在最小的溶剂用量和最短的时间内得到快速提高。分别选取超声时间为0，5，10，15 min进行萃取，当超声时间达5 min时萃取效率较高，继续增加萃取时间，回收率无明显变化，当萃取时间大于10 min后，萃取回收率反而减小。这可能是因为超声过程中产生的热量使得磺胺类抗生素重新溶解回水相，导致萃取量下降。因此，实验选择超声时间为5 min。

2.7 线性方程、检出限、准确度及精密度

在优化条件下，分别对系列浓度磺胺类抗生素的混合标准工作溶液进行测定，以磺胺类抗生素的色谱峰面积(y)对其质量浓度(x，μg/L) 进行线性回归。结果显示，13种磺胺类抗生素在一定质量浓度范围内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.998，以3倍信噪比(S/N=3) 计算仪器检出限(LOD) 为0.6～2.4 ng/L，以S/N=10计算得到方法的定量下限(LOQ)为2.0～7.9 ng/L，实验结果见表2。

2.8 回收率与精密度

选取阴性水样，分别添加3个浓度水平的磺胺类抗生素混合标准溶液，混合均匀后，按照“1.3”方法进行前处理和色谱检测，每个浓度水平平行测定5次，计算回收率和相对标准偏差(见表3)。结果显示，13种磺胺类抗生素在3个加标水平下，平均回收率为80.3%～101.8%，相对标准偏差(RSD，n=5)为0.7%～4.5%，方法能够满足水样中多种磺胺类抗生素的测定要求。图2为阴性水样在低加标水平的MRM图。

表2 13种磺胺类药物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限与定量下限

图2 空白水样中加入13种磺胺类抗生素的MRM图

AnalyteSpiked(μg/L)Found(μg/L)Averagerecovery(%)RSD(%)SPP115，460，230107，423，206930，920，89619，28，17SDM158，630，315139，561，285880，890，90526，30，45SDM′0595，238，1190560，210，110941，882，92416，13，25SQX108，434，2170970，369，179898，850，82509，14，23SCP165，660，330168，648，2971018，982，90024，31，36SPZ115，460，230106，415，211922，902，91717，13，08SMM0785，314，1570640，252，133815，803，84723，27，29SBZ110，440，220107，406，224973，923，101831，15，24SSX142，566，283133，488，256937，862，90527，14，07

(续表3)

AnalyteSpiked(μg/L)Found(μg/L)Averagerecovery(%)RSD(%)SMZ145，580，290134，501，274924，864，94514，16，24SMP118，474，2370995，381，193843，804，81435，42，27SM2′151，602，301126，491，242834，816，80421，17，32SM2188，752，376175，678，331931，902，88016，23，35

图3 水样中检出SDM′的MRM图Fig.3 MRM chromatogram of SDM′ in water sample

2.9 实际水样的测定

采用本方法对5份自来水、2份某养猪场污水、1份养鱼池塘水进行测定。结果表明，2份养猪场水样中均检出SDM′(浓度分别为120 ng/L和270 ng/L)，1份池塘水样中检出SM2(浓度为19.2 ng/L)，5份自来水中均未检出13种磺胺类抗生素残留。养猪场水样中检出SDM′的MRM图见图3。

3 结 论

本文所建立的UA-DLLME-UPLC-MS/MS法具有操作简便、萃取速度快、萃取效率和富集倍数高 、试剂消耗量少、重现性好、环境友好等优点，可用于实际水样中多种磺胺类抗生素的测定，具有一定的实用参考价值。

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Determination of 13 Sulfonamide Residues in Water by Ultrasound-assisted Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

LI Xiao-jing*，YU Hong，YANG Rong，GAN Ping-sheng，LIU Miao，LI Zhi-feng

(Guangzhou Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou 510440，China)

A simple and rapid method was established for the preconcentration and determination of 13 sulfonamide residues in water samples by ultrasonic-assisted dispersive liquid-liquid microextraction(UA-DLLME) coupled with ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry(UPLC-MS/MS)．The target compounds in water samples were synergistically extracted in ultrasonic dispersed mode and separated on a C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm) column with acetonitrile-0.1% formic acid solution as mobile phase，and determined by UPLC-MS/MS under multiple reactions monitoring(MRM) mode．The kind and dosage of extraction agent and dispersing agent，extraction time，dosage of sodium chloride and pH conditions were optimized．Under the optimized conditions，the calibration curves of 13 sulfonamides were linear in the certain concentration range with correlation coefficients greater than 0.998.The detection limits of the method(S/N=3) were between 0.6 ng/L and 2.4 ng/L.The average recoveries of sulfonamides at three spiked levels in water sample ranged from 80.3%to 101.8%with relative standard deviations(RSD，n=5) of 0.7%-4.5%.The developed method was simple，environment-friendly and sensitive,and was suitable for the determination of multiple sulfonamide residues in water.

ultrasonic-assisted dispersive liquid-liquid microextraction(UA-DLLME)；ultra performance liquid chromatography coupled with tandem quadrupole mass spectrometry(UPLC-MS/MS)；sulfonamide；water

2016-03-25；

2016-04-13

广东省医药科学技术研究基金项目(B2015095)；广州市医药卫生科技项目(20151A011052)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.006

O657.63；S816.73

A

1004-4957(2016)10-1255-06

*通讯作者：李晓晶，硕士，副主任技师，研究方向：食品安全、仪器分析，Tel:020-36545120，E-mail:saiint@163.com