利用真核微藻表达外源蛋白的现状与展望

房 磊 范建华 李元广（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

利用真核微藻表达外源蛋白的现状与展望

房 磊 范建华 李元广（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

近年来，随着基因工程技术的迅猛发展，利用真核微藻表达外源蛋白技术得到广泛关注。综述了真核微藻表达外源重组蛋白的研究现状，并分析了其中存在的关键科学问题。在此基础上，阐述了真核微藻作为新型表达系统所面临的机遇与挑战，最后展望了真核微藻表达重组蛋白的发展前景。

房磊，博士研究生，研究方向为微藻基因工程。

E-mail:fangleismile@163.com

微藻生物资源具有集“碳减排、新能源、大健康、水处理”于一体的独特优势，微藻这一战略性新兴产业可以被培育为一个应用面广的“大产业”，其发展对当前及未来经济和社会发展有着巨大推动作用，已成为当今世界生物技术领域的研发热点。微藻作为一种“活细胞生物反应器”，不但可以充分吸收环境中排放的CO2，解决工厂CO2的点源排放问题，缓解温室效应，而且通过基因工程改造可以满足人类对水产养殖、生物柴油、医药蛋白1、保健品2、饲料3、功能食品4的需要。因此，微藻的基因工程研究备受科技工作者的关注。

微藻作为“天然的绿色工厂”，可以高效表达药物蛋白、功能蛋白、食品添加剂等一系列高附加值产品。与细菌的表达系统相比，真核微藻可以完成复杂的蛋白质折叠，形成有活性的蛋白；与酵母表达系统相比，可以进行糖基化，满足人们对抗原、抗体特异性需求；与转基因植物相比，其培养周期短、受季节等外界环境的限制较少；与动物细胞培养相比，生产成本（蛋白质未纯化）不到动物细胞培养的万分之一5，并且可以实现微藻规模化培养。此外，微藻来源的蛋白具有生物相容性，可以不进行纯化，直接被动物食用，大大降低纯化回收的成本。

属于蓝细菌的Synechocystis PCC 6803是研究较为透彻的原核微藻，目前在其中已经成功实现Flounder growth hormone、Acyl-acyl carrier protein thioesterase、Hydrogenase等多种外源蛋白的表达。由于原核微藻除了核糖体以外不具有其他细胞器，不具备蛋白质加工修饰的功能，且蓝细菌普遍生长较为缓慢，导致重组蛋白的产率低，因而近年来利用真核微藻表达外源蛋白技术逐渐得到关注。但目前来说，利用真核微藻生产外源重组蛋白技术尚未获得重大突破，理论基础研究和应用基础研究亟待加大投入，以期尽快为微藻战略性新兴产业的形成提供新的增长点。本文仅对利用真核微藻作为表达系统表达外源蛋白的现状进行分析并对其发展前景进行展望。

1 真核微藻表达外源蛋白的国内外研究进展

莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是真核微藻中研究最为成熟的表达系统。目前，已在微藻中表达了34种不同的外源蛋白，仅莱茵衣藻中就有29种6。为满足全球每年1400亿元药物蛋白的市场需求7，迄今已成功在C.reinhardtii中表达多种外源蛋白如：The fourteenth human fibronectin type III domain（14 FN3）8、The tenth human fibronectin type III domain（10 FN3）8、Immunoglobulin G（IgG）9～11等抗体药物；E7 protein of the Human Papilloma virus type 16 （16 E7）12、Immunotoxins13、Pfs48/4514等疫苗；Erythropoietin15、Bovine milk amyloid A（MAA）16、 Proinsulin8等功能药物； Human tumor necrosis factor related apoptosisinducing ligand（hTRAIL）17、Allophycocyanin18等抗肿瘤药物。此外，莱茵衣藻也可以高效表达Xylanase19等食品添加剂。但现有文献报道中C.reinhardtii存在生长速率慢、细胞密度低、规模化培养技术不成熟、外源蛋白表达含量低等问题，限制了其产业化进程。

小球藻具有生长周期短、细胞密度高、营养价值高等优势，因此继C.reinhardtii后，也成为基因工程的主要研究对象。目前成功在椭圆小球藻（Chlorella ellipoidea）中实现了α-defensin20、Flounder growth hormone21的高效表达，在普通小球藻（Chlorella vulgaris）中实现了Lactoferrin22的高效表达。Fan等23首次完成了国际上首个可食用且可规模化培养的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的全基因组测序并成功实现了外源基因的转化。笔者所在团队在国际上首创了微藻培养领域的一项崭新的平台技术——异养-稀释-光诱导串联培养（SHDP）技术24，已经成功实现了小球藻高密度高品质培养，其异养培养的平均生长速率不低于3g/（L·h），最高藻细胞密度可高达150g/L，已用于小球藻粉的工业化生产，这一技术的产业化为小球藻作为外源蛋白表达平台的研发奠定了重要基础。

此外，在三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）11、杜氏盐藻（Dunaliella salina）25等真核微藻中也实现了外源蛋白的表达（表1）。

2 真核微藻基因工程技术存在的关键科学问题分析

微藻作为“资源节约型、环境友好型”的可再生生物资源，符合全球倡导的“低碳经济、可持续发展”的战略，以其作为生物反应器表达外源蛋白具有潜在的商业价值。但是现有技术下的蛋白表达效率较低，导致其生产成本高，距实现产业化开发还有距离。分析其原因主要有以下几点。

①在表达场所方面，叶绿体转化系统的表达效率高于核基因组，但是实现叶绿体转化的微藻相对较少，目前主要有C.reinhardtii6、 D.salina22等微藻，但其培养周期长、细胞密度低，不利于外源蛋白的产业化研究。而生长速度快且营养价值高的微藻（如小球藻）的培养周期短、细胞密度高、培养工艺成熟，但尚未建立一套完善的小球藻叶绿体转化系统。

②在整合位点方面，微藻细胞中尚未发现适合外源基因的整合热点。微藻的基因工程研究远远落后于动物细胞，微藻的遗传背景尚未研究透彻，外源基因大多以随机插入或者某一位点的同源重组整合到基因组中，外源蛋白的表达可能会影响到自身蛋白的功能发挥，导致代谢发生紊乱。这些因素导致外源基因在转基因微藻中表达的精确调控与预期的目标间仍有差距。为此，尚需对微藻的基因组和比较基因组进行系统研究，分析并找到适合引入外源基因的整合热点。

注：“—”表示引用文章报道能够检测出相应物质，但是检测量低，没有报道具体数值。

③在提高外源基因表达效率方面，微藻转入外源基因后，容易出现表达效率低、基因沉默、微藻的生长速率受到限制等一系列问题。为此需要找到一种使外源基因高效表达的方法。研究表明通过启动子35、终止子36的优化，利用2A肽耦联技术19，质粒线性化37，叶绿体转化38，增强子、操纵子39、内含子40以及3’端非转录区41的使用，密码子优化42，Kozak序列的引入43，信号肽的使用44，利用核基质结合区（MARs）45，使用转录因子-UAS表达系统46，增加基因的拷贝数47等一系列措施均可以增加转录、翻译效率，进一步提高外源基因的表达效率。因此，需要了解和掌握基因的表达机制，从而探索高效、大量表达外源基因的方法。

综上所述，现阶段利用微藻作为表达系统生产外源蛋白技术的关键突破，需要集中在转基因的精确表达、高效调控上48。

3 利用真核微藻生产外源蛋白面临的机遇与挑战

3.1 真核微藻生产外源蛋白所面临的机遇

当前，微藻生物技术已步入快速发展阶段，除了把微藻开发成传统意义上的新食品原料、功能食品等大健康产品外，随着新能源、碳减排和环保等方面的迫切需要，微藻在生物能源、生物固碳、富含氮磷废水处理、动物饲料及食品等行业具有十分广阔的应用前景。在C.reinhardtii中已经证实微藻是一个良好的“活细胞生物反应器”，可以表达多种外源高附加值产品，微藻的转基因研究面临着新的机遇。

首先，真核微藻满足“绿色经济、可持续发展”的战略需求。“能源危机、全球气候变暖”等问题亟待解决，微藻生物技术的产业化受到政府、企业的大力支持及科研工作者的青睐。国家投入充足的科研经费用于微藻生物技术的相关研究，必将大力推动微藻遗传背景的认识以及基因工程领域的技术突破，这为微藻作为生物反应器表达外源蛋白技术的发展提供了良好的机遇。

其次，真核微藻具备表达高附加值产品的优势。微藻具有叶绿体、线粒体、内质网、高尔基体等多种细胞器，可以完成复杂的蛋白质折叠与修饰，是外源蛋白表达系统的不二之选。美国食品与药品管理局（FDA）将微藻列为安全食品49 50，因此利用微藻表达的外源蛋白可省去提取、纯化费用，大大提高了藻源蛋白的竞争优势。

3.2 真核微藻生产外源蛋白所面临的挑战

微藻转基因及其产业化研究具有广阔的市场前景，但是实现这一目标的道路是曲折的。目前微藻表达高附加值产品的含量都相对较低，导致生产成本居高不下，限制了其产业化进程。此外，转基因产品安全问题备受争议，因此利用转基因微藻表达外源蛋白要经过各种验证安全后才能使用。如藻源蛋白易于糖基化，使其表达的外源蛋白具有免疫原型51，作为疫苗等药物静脉注射到人体后可能会产生免疫排斥，因此，藻源的外源蛋白需要经过繁琐的动物实验和多期临床试验，这无形中增加其产业化的成本。另外，微藻转基因技术尚未成熟，微藻生产重组蛋白在衣藻、三角褐指藻、集胞藻6803等模式微藻中已经取得突破，但藻细胞生长速率较低、藻细胞营养成分少，应用价值低；而在生长快营养价值高的小球藻等微藻中，已成功实现核基因组转化（集中在电击转化、农杆菌介导、原生质体转化等方面），但稳定性、表达效率亟待提高，并且更加高效的叶绿体转化、同源重组、RNAi、CRISPR/Cas9体系等技术均尚未突破，需要投入更大精力开展系统的研究。

4 真核微藻表达重组蛋白的发展前景

随着微藻生物技术的进步，真核微藻表达外源蛋白的研究将会不仅仅限于C.reinhardtii、P.tricornutum、 C.ellipsoidea、C.vulgaris、C.pyrenoidosa、D.salina等几种微藻，将会有更多的微藻应用于基因工程研究，特别是那些具有商业价值的微藻。在洞悉微藻的理化性质和遗传背景的前提下，建立微藻的转录组和代谢组学，实现人们的预期目标与微藻基因表达的精确调控相统一的目标，使代谢流集中在目标蛋白的生产上，避免造成能源浪费，走“最少的投入、最大的产出”绿色经济路线，是微藻基因工程研究的下一步目标。

基因工程技术日新月异，借助真核微藻这一“活细胞生物反应器”表达外源蛋白、食品添加剂及工业原料，将会降低医药及功能食品的成本，解决医药蛋白和功能食品价格昂贵的问题。这预示未来的转基因研究将聚焦以微藻作为生物反应器的研究，可满足人们对高附加值产品的需求，具有广阔的应用前景。

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10.3969/j.issn.1674-0319.2016.03.003