日本血吸虫钙网质蛋白活化宿主巨噬细胞的初步研究

马丽贞，李丹丹,2，苑纯秀，艾 敏，史晓娜,2，塔 娜，冯新港

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开发实验室，上海200241；2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234）

·研究论文·

日本血吸虫钙网质蛋白活化宿主巨噬细胞的初步研究

马丽贞1，李丹丹1,2，苑纯秀1，艾 敏1，史晓娜1,2，塔 娜1，冯新港1

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开发实验室，上海200241；2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234）

为研究日本血吸虫钙网质蛋白（Schistosoma japonicum calreticulin protein，SjCRT）活化小鼠巨噬细胞的功能，利用杆状病毒昆虫细胞表达系统所表达的真核重组的SjCRT蛋白与巨噬细胞共培养72 h，采用流式细胞术检测巨噬细胞表面趋化因子受体CCR7的表达。收集SjCRT蛋白刺激72 h后的巨噬细胞，抽提RNA并反转录为cDNA，利用RT-PCR检测环加氧酶（cyclooxygenase，COX-2）、磷脂酶A2 （phospholipases A2，PLA2）、TNF-α和IL-1β基因的表达。SjCRT与巨噬细胞共孵育72 h后收集上清，ELISA检测上清中TNF-α的含量，Griess法测上清中NO的含量。流式结果显示，与对照组相比，SjCRT蛋白刺激组的巨噬细胞表面CCR7的表达量增高且差异具有显著统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比，SjCRT蛋白刺激组巨噬细胞的COX-2、cPLA2、TNF-α和IL-1β表达量显著升高。ELISA结果显示，SjCRT能够刺激巨噬细胞分泌致炎性因子TNF-α。Griess法表明SjCRT能够促进巨噬细胞分泌NO。本研究结果表明SjCRT能活化小鼠巨噬细胞，为阐明其在RA血吸虫疫苗中的功能等提供基础资料。

日本血吸虫；钙网质蛋白；巨噬细胞；趋化因子受体；细胞因子

日本血吸虫病目前仍是严重威胁我国人畜健康、制约我国经济发展的一大疾病[1]。开发高效、安全、实用的抗血吸虫疫苗是实现控制血吸虫病的保障[2]。大量研究表明，通过模拟辐照致弱血吸虫尾蚴或童虫疫苗（radiation attenuated vaccine，RAV）诱导的高保护性效应机理来研发高效而又安全的分子疫苗可能是一条值得探索的新途径，因此探索RAV的高保护性效应机制成为学者们关注的热点课题，其中RAV的免疫原性分子与细胞基础及机制等问题尤其受到重视[3]。研究表明，RA血吸虫疫苗能够诱生高保护性免疫效果，其机制可能是通过RA 血吸虫来源的分子刺激宿主免疫细胞在肺部形成了以Th1为主的致炎性环境而实现的[4]。发现和鉴定这些保护性分子并阐明其免疫生物学功能，对研发高效安全的抗血吸虫分子疫苗具有重要的指导意义。

Perona-Wright等[5]鉴定了曼氏血吸虫的钙网质蛋白（calreticulin，CRT）是辐照致弱血吸虫疫苗的一种免疫显性T细胞抗原。本实验室陈雷等[6]发现日本血吸虫的钙网质蛋白（Schistosoma japonicum calreticulin protein，SjCRT）含有一个杂合型的Th1细胞表位。李莹等[7]的研究结果也显示SjCRT在RA日本血吸虫童虫（7日龄）来源的细胞中呈现出高表达，且可以刺激小鼠树突状细胞的表型成熟。据此，我们初步推断SjCRT可能是RA血吸虫来源的候选保护性分子，并且在诱导宿主形成致炎性环境中发挥一定的作用。相关的研究还显示，巨噬细胞在介导杀灭肺期童虫和形成肺部炎性反应环境中发挥重要作用[8]。本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型，检测其在SjCRT刺激下致炎性细胞因子及趋化因子受体等的分泌表达情况，为进一步鉴定SjCRT的致炎性免疫生物学特性、阐明其在RA血吸虫疫苗中的功能等提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 蛋白 SjCRT蛋白为中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室构建保存的杆状病毒昆虫细胞表达系统所表达[7]。

1.2 巨噬细胞 RAW264.7小鼠巨噬细胞株为中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室保存。

1.3 主要试剂 DMEM培养基购自Invitrogen公司；胎牛血清购自Gibco公司；PE标记的抗CCR7单抗购自BD公司；反转录试剂盒购自TaKaRa公司；Mouse TNF-α ELISA Ready-SET-Go Kit购自eBioscience公司；GoTaq®qPCR Master Mix Kit 购自Promega中国公司；NO检测试剂盒购自普利莱基因技术有限公司；引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司引物合成；其他试剂为进口或国产分析纯。

1.4 引物设计 根据小鼠GAPDH、cPLA2、COX-2、TNF-α、IL-1β的基因序列，利用primer5.0软件分别设计针对这几个基因的特异性引物，由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，其序列见表1。

表1 扩增基因所用引物Table1 Primers used in RT-PCR

1.5 实验方法

1.5.1 巨噬细胞的培养 RAW264.7细胞复苏后，用含体积分数为10%的胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基培养，并置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中定期传代。实验时采用处于对数期生长的细胞。

1.5.2 SjCRT蛋白刺激巨噬细胞 调整巨噬细胞浓度为1×107个/mL，加入48孔细胞培养板中（100 μL/孔），实验组加入真核表达蛋白SjCRT，调节浓度为 50 μg/mL，同时设未刺激组和LPS（50 ng/mL）对照组，补充培养基至1 mL/孔。37℃、5%CO2培养箱继续培养。

1.5.3 ELISA检测SjCRT刺激巨噬细胞后TNF-α的分泌情况 按照上述方法处理巨噬细胞并收集培养细胞的上清。按照说明书要求稀释各种溶液，将包被抗体加至96孔酶标板中（100 μL/孔），4℃包被过夜；0.05% PBST洗3遍，用200 μL assay diluent室温封闭1 h；0.05%PBST洗3遍，将样品及标准品加到96孔板合适的孔中室温孵育2 h（100 μL/孔）；0.05% PBST洗3遍，每孔加入100 μL 检测抗体室温孵育1 h；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100μL 酶标二抗，室温避光孵育30 min；0.05%PBST洗3遍，加入底物显色液（100 μL/孔），室温避光孵育15 min；每孔加入50 μL 终止缓冲液终止显色后测OD450值。

1.5.4 RT-PCR检测TNF-α和IL-1β转录水平的变化 继续培养巨噬细胞72 h后，收集细胞，PBS洗2遍，加入800 μL RNAiso plus将细胞悬起，室温放置5 min；4℃、10 800×g离心5 min后，将上层液体转移到新的离心管中；加入200 μL 氯仿大力涡旋2 min左右使其成乳状，室温放置5 min。4℃、10 800×g离心15 min，将上层液体转移到新的离心管中，加入500 μL 异丙醇混匀后置-80℃冰箱3 h；4℃、10 800×g离心10 min，弃上清后加入700 μL 75%酒精冲洗RNA；4℃、7500×g离心5 min，弃干净上清，置空气中干燥；用20 μL 灭菌蒸馏水溶解并测浓度。利用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。按照GoTaq®qPCR Master Mix Kit（Promega，China）说明书使用ABI 7900HT Real-Time PCR System进行如下反应：95℃预变性2 min；95℃预变性15 s和60℃退火1 min，40个循环。添加扩增产物的溶解曲线来确定反应的特异性。利用2-△△CT法计算目的基因mRNA的相对表达。

1.5.5 流式细胞术检测巨噬细胞表面趋化因子受体CCR7的表达 继续培养巨噬细胞72 h后，收集细胞。4℃、10 800×g离心5 min，沉淀用200 μL RPMI1640悬起，加入2 μL Rat Anti-Mouse CD16/ CD32 抗体，4℃封闭30 min消除抗体非特异性结合；加入PE标记的Rat Anti-Mouse CCR7单抗，4℃避光孵育30 min；4℃、10 800×g离心5 min，用预冷的PBS洗2遍，加入400 μL PBS悬起转至流式管中，上流式仪检测。

1.5.6 Griess法检测SjCRT刺激巨噬细胞后NO的分泌情况 收集上述培养细胞的上清。按照说明书要求取50 μL标准品和样品加入96孔板中，每孔加入50 μL Griess R1室温避光放置5 min；每孔加入50 μL的Griess R2室温避光放置5 min；540 nm测定吸光度。制备标准曲线并计算NO的浓度。

1.6 数据处理 所有的数据利用t检验进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异具有显著统计学意义，借助GraphPad Prism 5等软件对所得数据进行分析和绘图。

2 结果

2.1 SjCRT诱导巨噬细胞高表达前炎性细胞因子TNF-α 以ELISA检测巨噬细胞分泌至上清中的TNF-α含量，由图1可以看出，LPS刺激组和SjCRT刺激组中TNF-α的含量显著高于对照组且差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）。由此可知，SjCRT的刺激能够促进巨噬细胞分泌前炎性因子TNF-α。

图1 SjCRT刺激巨噬细胞产生细胞因子TNF-αFig.1 Cytokine TNF-α production of macrophagocyte stimulated by recombinant SjCRT

2.2 SjCRT促进巨噬细胞上调表达COX-2、cPLA2、TNF-α和IL-1β mRNA 经过SjCRT和LPS处理后的巨噬细胞COX-2、cPLA2、TNF-α和IL-1β的mRNA均上调，但上调的幅度有所不同。与对照组相比，SjCRT刺激组的COX-2 mRNA表达量是对照组的6.25倍，cPLA mRNA表达量增加了20.61倍，TNF-α mRNA表达量增加了6.87倍、IL-1β mRNA表达量上调了233.51倍（图2）。

图2 巨噬细胞表达COX-2、cPLA2、TNF-α和IL-1β的RT-PCR分析Fig.2 mRNA expression of the COX-2, cPLA2, TNF-α and IL-1β by RT-PCR

2.3 SjCRT促进趋化因子受体CCR7在巨噬细胞上表达 由图3的流式结果可知，未经处理的巨噬细胞能表达一定水平的CCR7，但SjCRT和LPS的刺激能使巨噬细胞表面趋化因子受体CCR7的表达水平极显著地增加。与对照组相比，SjCRT刺激组能促进巨噬细胞表面高表达趋化因子受体CCR7且差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）。SjCRT刺激组与LPS刺激组相比，巨噬细胞表面CCR7的表达差异无显著统计学意义（P＞0.05)。

2.4 SjCRT诱导巨噬细胞分泌NO 以Griess检测巨噬细胞分泌到上清中的NO含量，由图4可以看出，LPS和SjCRT的刺激能够促使巨噬细胞分泌NO，且SjCRT刺激组的含量与对照组差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）。

图3 流式细胞仪分析CCR7在巨噬细胞表面的表达Fig.3 FACS analysis of CCR7 expression on Macrophagocyte

图4 SjCRT刺激巨噬细胞产生NOFig.4 NO production of Macrophagocyte stimulated by recombinant SjCRT

3 讨论

近年来的研究显示，辐照可引起免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）[9]。ICD的显著特征是通过释放或表面表达所谓的危险信号分子如HSP70、HMGB1和CRT等分子来增强免疫应答。本实验室前期研究也发现经辐照的日本血吸虫尾蚴，体外转化的早期童虫的细胞呈现明显的坏死表型，且SjCRT和SjHSP70能够表达在RA尾蚴转化的童虫细胞表面[10]，提示SjCRT和SjHSP70很可能在RA日本血吸虫疫苗诱导的保护性免疫中发挥重要作用。研究揭示，RA血吸虫免疫小鼠后在宿主肺部和引流淋巴结诱导了偏向于Th1的保护性应答，其中活化的免疫细胞如树突细胞、巨噬细胞和T细胞等分泌的IFN-γ和TNF-α起了关键作用。但是，SjCRT是否也能够活化巨噬细胞从而有利于宿主产生Th1的保护性应答环境，尚有待研究验证。本研究通过测定经SjCRT刺激的小鼠巨噬细胞的趋化因子受体和细胞因子的表达情况，初步证明SjCRT可诱导小鼠巨噬细胞产生较高水平的TNF-α等致炎性细胞因子及趋化因子受体CCR7。

研究表明活化的巨噬细胞能合成和分泌大量细胞因子。因此，通过测定巨噬细胞分泌表达相关细胞因子的情况可以推断其功能活性。本研究分别用ELISA法和RT-PCR法在蛋白水平和转录水平测定了受刺激的巨噬细胞TNF-α的含量，发现SjCRT可刺激巨噬细胞高表达前炎性细胞因子TNF-α。另外，我们也检测到IL-1β mRNA在受刺激的巨噬细胞上呈现高表达。相关的研究显示TNF-α和IL-1β是重要的诱导炎症反应的细胞因子[11]，在炎症发生早期，作为重要的早期炎症因子，参与了固有免疫和适应性免疫反应。TNF-α具有刺激单核/巨噬细胞等合成、分泌细胞因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等），导致炎性细胞浸润和增强吞噬细胞的杀伤作用。IL-1β是巨噬细胞激活 T 细胞的重要介质，有调节免疫应答的作用。SjCRT能够诱导巨噬细胞高表达TNF-α和IL-1β mRNA，分泌早期炎症因子TNF-α，提示巨噬细胞被活化。至于被SjCRT活化的巨噬细胞是否在宿主体内通过TNF-α和IL-1β诱导了早期炎症反应并参与了激活T细胞等免疫反应，尚有待我们进一步实验证实。

巨噬细胞炎症反应功能的活化还可以通过测定与前列腺素类炎症介质合成相关的诱导酶COX-2和胞浆性磷脂酶A2（cPLA2）表达情况来反映。通常炎症的产生机制是机体在受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等刺激后产生炎症性细胞因子，刺激和活化PLA2，引发磷脂的水解并产生花生四烯酸，在COX的作用下进一步转变为前列腺素类炎症介质，进而机体发生炎症症状[12]。COX是前列腺素合成的限速酶，有COX-1和COX-2两种结构。COX-1是组成酶，在大部分组织中稳定表达，参与体内的正常代谢；COX-2是诱导酶，在正常组织中不表达，只有在被细胞因子、生长因子等刺激后才大量表达，从而导致前列腺素含量的增加，引起炎症、疼痛等症状[13]。根据生物活性的不同，可将PLA2分为3类：分泌性磷脂酶A2（sPLA2）、胞浆性磷脂酶A2（cPLA2）和Ca2+非依赖性磷脂酶A2 （iPLA2），但只有cPLA2对花生四烯酸的产生有调控作用。本研究发现受SjCRT刺激的巨噬细胞具有上调cPLA2和COX-2基因表达的趋势，提示巨噬细胞具有较强的炎症反应功能。

活化的巨噬细胞不仅分泌细胞因子，也能合成NO，通过测定巨噬细胞NO的含量变化可以反映其功能活化的状态。另外，有研究显示由巨噬细胞产生的NO在杀灭肺期血吸虫童虫时起重要作用[14,15]。本研究结果显示受SjCRT刺激的巨噬细胞分泌NO的能力显著增强，提示巨噬细胞的炎症反应功能被活化。至于RA日本血吸虫来源的SjCRT在体内是否也能通过巨噬细胞产生的NO来消除肺部的血吸虫童虫，仍有待进一步的鉴定。

募集免疫细胞至淋巴结器官对于诱导宿主保护性免疫反应及免疫耐受的调节等至关重要，这一过程是表达在免疫细胞表面的CCR7受体以及表达于淋巴结细胞上的趋化因子配体CCL21 等介导的[16]。有关的研究表明在致炎性的M1巨噬细胞和成熟的树突细胞表面CCR7呈现高表达，有利于这些细胞被募集到免疫效应器官如肺部和引流淋巴结，进而产生细胞毒效应或活化其他免疫细胞。本研究中，我们发现SjCRT刺激后巨噬细胞上调表达CCR7，提示SjCRT刺激后的巨噬细胞可能具有致炎性的M1巨噬细胞的功能。

本研究结果表明SjCRT具有促进巨噬细胞产生致炎症反应的功能，为进一步阐明SjCRT在RA血吸虫疫苗诱导的保护性免疫中所发挥的功能及其机制提供了有价值的资料。

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PRELIMINARY STUDY ON EFFECT OF SCHISTOSOMA JAPONICUM CALRETICULIN PROTEIN ON ACTIVATION OF MACROPHAGOCYTES

MA Li-zhen1, LI Dan-dan1,2, YUAN Chun-Xiu1, AI Min1, SHI Xiao-na1,2, TA Na1, FENG Xin-gang1
(1.Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

The objective of the present study was to investigate into the functions that Schistosoma japonicum calreticulin protein (SjCRT) activated mouse macrophagocytes.Insect cells Sf9 were used to express SjCRT.Macrophagocytes were stimulated with SjCRT for 72 h.The expression levels of macrophagocyte surface chemokine receptor CCR7 were assayed with fl ow cytometry.The expression levels of COX-2, cPLA2, TNF-α and IL-1β mRNAs were assayed in RT-PCR.The ELISA was used to assay the concentration of TNF-α and Griess to assay the concentration of NO in the surpernatant samples.The fl ow cytometry results show that SjCRT signifi cantly promoted up-regulation of the CCR7 expression (P＜0.05) in macrophagocytes.RT-PCR results indicated that SjCRT upregulated mRNA levels of COX-2, cPLA2, TNF-α and IL-1β.According to the results of ELISA and Griess, SjCRT signifi cantly stimulated macrophagocytes to secret NO.In brief, SjCRT activated mouse macrophagocytes that might be involved in the response to schistosomiasis vaccination.

Schistosoma japonicum; calreticulin protein; macrophagocyte; chemochines recepters; cytokine

S852.735

A

1674-6422（2016）02-0047-06

2016-12-18

中国农业科学院创新团队基金

马丽贞，女，硕士研究生，预防兽医学专业

冯新港，E-mail：xingangf62@yahoo.com.cn