光学干涉断层成像对球囊损伤联合高脂喂养兔腹主动脉粥样硬化模型的认定价值

罗明华++++++王贺++++++司春婴++++++关怀敏++++++解金红++++++陈玉善++++++邱承杰++++++董文杰

[摘要] 目的 探索光学干涉断层成像（OCT）技术在球囊损伤联合高脂喂养兔腹主动脉粥样硬化模型中的价值。 方法 20只日本大耳白兔，通过完全随机化的方法随机分配至实验组与对照组，各10只，实验组采用球囊损伤加高脂喂养8周的方法制作动脉粥样硬化模型，对照组采用球囊损伤加普通喂养的方法。8周后OCT观察内膜增殖及管腔狭窄程度，而后病理观察斑块性质，考察OCT与病理检查对粥样硬化结果的吻合程度。 结果 实验组饲养后三酰甘油[（1.12±0.42）mmol/L比（0.59±0.35）mmol/L，P < 0.05]、总胆固醇[（12.17±3.14）mmol/L比（1.23±0.25）mmol/L，P < 0.05]、低密度脂蛋白胆固醇[（11.43±3.12）mmol/L比（0.38±0.14）mmol/L，P < 0.05]较基线升高；病理显示实验组较对照组管壁更厚，内膜增殖更显著；OCT发现实验组管腔面积低于对照组[（4.34±0.22）mm2比（5.13±0.17）mm2，P < 0.01]，新生内膜面积[（2.55±0.19）mm2比（1.66±0.22）mm2，P < 0.01]及平均新生内膜厚度[（94±20）μm比（57±13）μm，P < 0.01]高于对照组，这与病理组织检查对内膜增殖结果的考察具有良好的一致性。 结论 球囊损伤联合高脂喂养的方法可以短期内制作出动脉粥样硬化模型，OCT能够清晰观察到兔腹主动脉粥样硬化模型内膜增殖特点及管腔狭窄程度，可以作为兔动脉粥样硬化模型成功与否的检测方法。

[关键词] 光学干涉断层成像；兔；粥样硬化；模型；内膜增殖

[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）09（a）-0004-05

[Abstract] Objective To explore the value of optical coherence tomography （OCT） for rabbits models with abdominal aortic atherosclerosis induced by balloon injury and high-fat feeding. Methods Twenty Japanese white rabbits were randomly divided into experimental group and control group by completely randomized method， with 10 rabbits in each group. The experimental group was taken balloon injury and high-fat feeding for 8 weeks to make aortic atherosclerosis models， while the control group was taken the method of balloon injury and normal feeding. After 8 weeks， the conditions of intimal hyperplasia and luminal stenosis were observed by OCT， the plaque characteristic was observed by pathologic examination， the coincided degree of OCT and pathologic examination for the results of aortic atherosclerosis was investigated. Results The levels of triacylglycerol [（1.12±0.42） mmol/L vs （0.59±0.35） mmol/L， P < 0.05]， total cholesterol [（12.17±3.14） mmol/L vs （1.23±0.25） mmol/L， P < 0.05]， low density lipoprotein cholesterin [（11.43±3.12） mmol/L vs （0.38±0.14） mmol/L， P < 0.05] in the experimental group after feeding were significantly increased compared with baseline； the pathologic examination showed that the tube wall of experimental group was thicker than that of control group， the intimal hyperplasia was more significant； OCT showed that， the lumen area of experimental group was lower than that of control group [（4.34±0.22） mm2 vs （5.13±0.17） mm2， P < 0.01]， the neonatal intimal area [（2.55±0.19） mm2 vs （1.66±0.22） mm2， P < 0.01] and average neonatal intimal area [（94±20） μm vs （57±13） μm， P < 0.01] were higher than those of control group， which had good consistency with pathologic examination for intimal hyperplasia. Conclusion The method of balloon injury combined with high-fat feeding can make aortic atherosclerosis models in short time， OCT can observe the characteristics of intimal hyperplasia and the degree of luminal stenosis of rabbits models with abdominal aortic atherosclerosis clearly， which can be used as the method for detecting the success or failure of rabbits models with abdominal aortic atherosclerosis.

[Key words] Optical coherence tomography； Rabbit； Atherosclerosis； Model； Intimal hyperplasia

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心、脑、肾等脏器缺血性疾病的病理基础，严重危害人类健康。建立AS动物模型对研究其病理改变、探索其发病机制具有非常重要的意义。兔是较常采用的实验动物，高脂喂养或球囊损伤联合高脂喂养的方法是目前使用较多的造模方法，但是，往往缺乏统一造模成功的标准。有仅仅高脂喂养8周或12周的[1-3]，有兔动脉球囊损伤后高脂喂养8周或16进行造模的[4-5]，亦有先高脂喂养4周，而后球囊损伤造模[6]，有研究采用血管钳夹技术联合高脂喂养6周进行造模者[7]，也有研究认为通过高脂喂养4～16周可以制作出不同病理分期的AS模型[8]。因此，适应相应临床研究需求的兔AS模型的制作仍然有待进一步研究。同样，兔AS模型成功与否的判断亦缺乏统一的标准，有研究通过血脂升高判断是否成功，有通过造影的方法，有研究间接超声探查颈动脉斑块判断[9]，亦有采用核磁共振技术进行检验者[10]。但是这些技术各有一定的缺点，血脂升高并不一定形成AS，造影的方法比较可靠，但造影发现狭窄前就已经存在粥样斑块，按照造影的标准需要延长模型的饲养时间，增加成本。光学干涉断层成像（OCT）是一种新型的影像学技术，具有微米级别的分辨率和出色清晰度，可明确AS斑块特点以及内膜增殖程度[11]。本研究拟建立一种稳定、可靠的兔AS模型，并通过与病理活检对比的方法，验证OCT方法在兔AS模型检测中的价值。

1 材料与方法

1.1 对象与分组

雄性日本大耳白兔[河南康达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（豫）2011-0001]20只，5月龄，体重2.5～3.0 kg，将兔按照体重依次编号，利用计算机随机生成两位数随机表，以随意一行开始，将数字与动物编号匹配，与随机数中的奇数匹配的动物被分至实验组，余下被分至对照组，实验组与对照组各10只。实验组球囊损伤腹主动脉后高脂喂养8周；对照组球囊损伤后普通喂养8周。实验兔在温度为22～27℃、湿度为50%的条件下喂养，高脂配方为在普通饲料中加入2%胆固醇、10%猪油和10%蛋黄粉。本研究通过了河南中医药大学第一附属医院动物伦理委员会的批准并按照动物福利相关规范实施。

1.2 兔腹主动脉粥样硬化模型的制作

日本大耳白兔（清洁级），预适应饲养1周后，术前3 d予阿司匹林25 mg/d，术前24 h禁食。20%乌拉坦5 mL/kg耳缘静脉麻醉，右股动脉剃毛、消毒、铺巾，钝性分离右股动脉。直视下穿刺股动脉，置入4F桡动脉鞘管，予以1000 U肝素抗凝。在C形臂X光机下，送入球囊导管至肾动脉以远腹主动脉，球囊直径与血管直径比约为1.2∶1，加压15～20 atm，缓慢回拉至腹主动脉分叉处，重复3遍，撤出器材，压迫血管10 min后缝合创口，包扎。术后每天1次肌注青霉素80万U，共5 d。实验组术后高脂喂养，对照组普通喂养。8周后OCT检查与病理检查。

1.3 血脂检测

入组时以及球囊损伤后8周空腹时从兔耳中动脉采集血液2 mL，全自动生化仪测定总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。

1.4 OCT检查

腹主动脉损伤后8周，采用上述方法麻醉，游离右侧股动脉，置入6F桡动脉鞘管，采用OCT仪（Light Lab Image Inc，USA）进行检查。置入指引导管，送导丝至肾动脉水平以远，送入成像导管（Image Wire，Light Lab Image Inc，USA）至目标血管。定位后，按照既定的方法[12]进行图像采集，应用C7X（Light Lab Image，USA）软件进行OCT图像分析。所有的图像资料均由2名经验丰富的临床医师分析。观察管腔内膜增殖情况，采用每1毫米（10帧图像）一帧观察统计，如果图像质量不佳则前后移动1～2帧，选取最佳者为研究图像。观察每个断层内膜厚度、斑块面积。

1.5 兔腹主动脉粥样硬化组织病理检查

将兔固定于兔台，剪去腹部被毛，75%乙醇局部皮肤消毒，1%盐酸利多卡因皮下局麻，沿腹正中线切口约10 cm，分离损伤处腹主动脉，脱水、包埋，切片和HE染色。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组资料比较采用独立样本t检验，成组资料采用配对t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型制作基本情况

研究纳入日本大耳白兔20只，死亡2只。对照组：死亡1只，在进行球囊损伤过程中突发死亡，可能与动脉损伤导致夹层有关。实验组死亡1只，在球囊损伤后高脂喂养过程中厌食，最终死亡。

2.2 血脂结果

对照组饲养前后TC、TG、LDL-C及HDL-C比较差异无统计学意义（P > 0.05），实验组饲养后TC、TG、LDL-C水平较基线明显升高（P < 0.05），实验组饲养后TC、TG、LDL-C水平显著高于对照组饲养后，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.3 病理检查结果

大体观，对照组动脉柔软富有弹性，颜色粉红，内膜光滑，个别标本可见脂质条纹，无明显斑块。实验组兔腹主动脉粗细不均，血管壁明显增粗，变硬，颜色黄白相间，肉眼可见管壁明显增厚，可见融合成片状的黄白条纹或斑块隆起于管腔。动脉管壁病变硬化分为5个级别[13]：0级，内膜光滑，无奶油样变化；1级，有明显的凸起奶油样斑块，面积小于3 mm2；2级，斑块面积大于3 mm2；3级，斑块融合成片，大部分斑块面积大于3 mm2；4级，斑块几乎覆盖整个动脉内膜。本研究中，实验组集中于2级与3级，而对照组集中于0级与1级。HE染色观察，对照组9例中仅有2例可观察到内膜轻微增殖变厚，中层平滑肌存在，其余则未见明显病理改变；实验组中9例均可见内膜增殖明显，管腔内部可见显著的脂质斑块存在，内膜下可见大量的泡沫细胞与淋巴细胞聚集，中膜平滑肌增生（图1）。

2.4 OCT检查结果

对照组OCT成像显示内膜较光滑，有一定程度的增殖，无斑块形成；实验组内膜增生明显，斑块负荷较重，新生内膜厚度更厚（图2），新生内膜面积显著高于对照组，平均新生内膜厚度高于对照组，管腔面积小于对照组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.5 OCT检查与病理结果比较

对照组与实验组腹主动脉管腔内膜最厚处进行病理与OCT检查结果进行分析，对照组均表现为轻度内膜增殖，实验组则表现为新生内膜更厚，动脉粥样斑块显著增殖，管腔面积下降明显。OCT结果与病理解剖结果具有较好的一致性。

3 讨论

AS动物模型研究很多，但目前尚无能够完美复制出精确病理的AS动物模型。兔是制作AS模型的候选动物，它成本低、操作方便，且脂代谢与人类有相似之处。但单纯高脂饲养短期内难以造出AS模型，且易生病，导致动物死亡。报道称单纯高脂喂养需要3～4个月的时间才能造成兔AS模型[14]。因而，往往采取球囊损伤联合高脂喂养的方式[5-6]造模。本研究即采取该方式进行造模，结果显示囊损伤联合高脂喂养8周，大体标本可以看到2、3级的动脉硬化，光镜可以看到所有动物表现为内膜增殖、显著脂质斑块、内膜下泡沫细胞与淋巴细胞聚集、中膜平滑肌增生等病理改变，提示该方法能够成功复制出满足后续实验需求的AS模型。

目前对AS模型的评价缺乏合适的方法，OCT能够成功检测到早期脂质条纹以及斑块[15]，且比血管造影的敏感性更高[16]。如果通过OCT检测到动脉内膜增殖、早期斑块的形成，可以认定AS模型的成功。Tian等[17]使用OCT检测通过氯化铁诱导的兔AS模型，显示了良好的结果。同时发现OCT检测结果与病理组织检查具有良好的同一性。Zhang等[18]利用OCT及IVUS观察兔AS模型的粥样斑块，结果发现OCT在对粥样斑块厚度及斑块性质的判断方面较IVUS具有较高的敏感性及实用价值。本研究通过物理损伤联合高脂喂养能够在相对较短的8周时间内制造出AS模型，OCT观察到内膜不均匀增殖，且与病理结果具有良好的一致性。

AS模型成功后，欲连续观察斑块进展以及消退，以往研究往往采取分批处死的方式，而缺乏同一动物动脉同一斑块连续检测的影像学数据。那么，通过OCT这一技术则能够解决这一瓶颈。本研究成功对兔腹主动脉进行侵入性球囊损伤后，再次介入的办法进行OCT检查，而且亦可通过其他的动脉入路进行再次的OCT检查。为此后的研究铺平了道路。Fulcher等[19]对高脂喂养兔腹主动脉AS模型研究中，采用不同入路对腹主AS靶点成功进行多次OCT图像采集。研究中，由于球囊损伤范围较大，可能造成较大范围与长度的AS改变。为了统一OCT探测范围以及组织学考察目标，本研究采用了Asml等[20]的研究方法，通过分叉血管作为标志点，在此标志点附近进行球囊损伤与OCT观察。另外，OCT检查耗材费用较高，为了节约实验成本，本研究重复使用了经过消毒的OCT成像导管，从而尽可能降低实验的成本。

总之，本研究通过球囊损伤联合高脂喂养的方式，短期内成功复制出兔腹主动脉AS模型，且该模型通过OCT以及病理组织学检验，均发现了新生内膜增殖、管腔面积减少等，具有良好的一致性，OCT技术可以作为兔AS模型成功与否的检测方法。

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