姜黄素对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用研究*

赵辛元,李 丹,柯志强

(1.湖北科技学院临床医学院，湖北 咸宁 437100;2.咸宁市中心医院；3.湖北科技学院糖尿病与心脑血管湖北省重点实验室)



姜黄素对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用研究*

赵辛元1,李 丹2,柯志强3**

(1.湖北科技学院临床医学院，湖北 咸宁 437100;2.咸宁市中心医院；3.湖北科技学院糖尿病与心脑血管湖北省重点实验室)

目的 探讨姜黄素对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及可能机制。方法 雄性SD大鼠110只,随机抽取10只大鼠作为正常对照组(Con组)，其余100只大鼠给予高糖高脂饮食喂养8周后,腹腔注射链脲佐菌素STZ 35 mg/kg，给药72h随机血糖≥16.7mmol/L为造模成功。糖尿病大鼠随机分为糖尿病肾病组(DN组)、姜黄素治疗组(DN+Cur组)。测定血清肌酐(Crea)、尿素氮(BUN)水平,测定肾脏组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)含量，测定24h尿蛋白含量,Western blotting方法检测肾脏组织中TGF-β1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表达。结果 姜黄素治疗后可明显改善糖尿病所致的大鼠血清中Crea、BUN升高变化，抑制肾脏中MDA的产生，并升高SOD、GSH-Px、CAT活性，减少24h尿蛋白含量，下调糖尿病大鼠肾脏组织TGF-β1、P62的蛋白表达，上调LC3-Ⅱ蛋白的表达。结论 姜黄素对大鼠糖尿病肾病具有保护作用，其机制可能与抑制氧化应激有关，可能与TGF-β1调控自噬有关。

糖尿病肾病；姜黄素；氧化应激；TGF-β1；自噬

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病并发症之一，使糖尿病的死亡率呈上升趋势。DN最经典定义是尿白蛋白进行性增加,与之相伴的是血压升高,肾小球滤过作用下降,最终导致肾衰[1]，与之伴随的复杂代谢紊乱，其发病机理目前尚不完全清楚。姜黄素(curcumin，Cur)是从姜科植物中提取的一种黄色酚类化合物，研究表明[1-3]Cur具有抗氧化、抗肿瘤、降糖、抗炎、免疫调节等作用。本研究通过复制DN模型，探讨Cur对DN的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 pH计(Mettler Toledo公司)；Scanspeed1730R高速冷冻离心机(丹麦Labgene公司)；自动发光凝胶成像系统(英国SYNGENE公司)；STZ(Sigma公司，货号S0130)；生化试剂盒均购于南京建成研究所；β-actin(谷歌生物)、TGF-β1、P62、LC3-Ⅱ(Sigma公司)；其余均为进口或者国产分析纯化学试剂。

1.2 分组情况 SPF级SD大鼠，健康雄性110只，体重100～160g，购于武汉大学实验动物中心。适应性喂养1周后，动物随机分为正常对照组(Con组，n=10)和糖尿病模型制备组(n=100)。Con组大鼠给予标准普通饲料喂养，糖尿病模型组大鼠以高糖高脂饲料(在普通饲料的基础上加入10%的白砂糖和20%的猪油)喂养。饲养4周后，禁食12h，糖尿病模型制备组大鼠一次性腹腔注射小剂量链脲佐菌素(streptozoticin，STZ)35mg/kg(用pH=4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)，正常对照组大鼠腹腔注射等容量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。STZ腹腔注射72h，鼠尾取血测定随机血糖。糖尿病模型成功大鼠诊断标准为：连续2次空腹血糖≥16.7mmol/L，未达成模标准者再次注射STZ，剔除仍未成功者。糖尿病模型成功大鼠51只，随机分为糖尿病肾病组(DN组，n=25)、姜黄素治疗组(DN+Cur组，n=26)。造模成功后，DN组大鼠继续喂以高糖高脂饮食，DN+Cur组大鼠则每天给予高糖高脂饲料和Cur300mg/kg(Cur由1%的羧甲基纤维素钠配制)处理。实验过程中，监测大鼠体重及摄食量。每2周禁食12h，鼠尾取血检测空腹血糖1次。Cur处理16周后，处死大鼠，检测后续相关指标。整个实验中仍有模型组死亡。

1.3 实验方法

1.3.1 血清中生化指标测定 实验末，腹主动脉取血，3000r/min离心10min，取上清，按照试剂盒说明书测定Crea、BUN含量。

1.3.2 肾脏组织中MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活力测定 药物治疗16周后取出肾脏，制备成肾脏匀浆，离心提取上清，按照试剂盒相关程序操作。

1.3.3 24h尿蛋白测定 处死大鼠前一天收集24h尿量，参照试剂盒说明书测定24h尿蛋白含量。

1.3.4 Western blot法检测肾脏组织中TGF-β1、P62和LC3-Ⅱ表达 取50mg肾脏组织置于EP管中，按照体重∶体积=1∶15的比例加入750μL组织裂解液，冰上匀浆后，15000r/min、4℃离心15min后，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，将蛋白浓度调为一致。上样后，80V电泳30min左右，将电压调为100～120V，溴酚蓝到凝胶底部4/5左右时停止电泳。300mA将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜后，TBST洗涤4次，5%脱脂牛奶室温封闭1h。加入用3%BSA参照抗体说明书稀释的一抗TGF-β1、P62、LC3-Ⅱ和β-actin(1∶1000)，置于4℃冰箱孵育过夜，TBST洗涤4次后，加入二抗(1∶5000)室温孵育1h。TBST漂洗后，化学发光(ECL)显影成像，SYNGENE自动发光凝胶成像系统检测目的蛋白表达情况，条带用Quatity One软件进行分析。

1.4 统计学方法 所有数据以均数±标准差表示，用SPSS 11.5统计学软件进行分析，行One-Way ANOVA检验，P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 Cur对STZ所诱导的糖尿病大鼠终体重、肾体质比、生化指标的影响 注射STZ之前，各组之间比较体重无显著性差异(P>0.05)。注射STZ造模成功后，DN组大鼠毛色黯淡无光泽，出现多食多尿，尿液浑浊，体重逐渐下降。实验末，与Con组相比，DN组大鼠体重均下降明显(P<0.05)；但与DN组比较，DN+Cur组大鼠体重显著升高(P<0.05)。

表1 姜黄素对STZ所诱导的糖尿病大鼠终体重、肾体质比、生化指标的影响±s)

与Con组比较，*P<0.05;与DN组比较，#P<0.05

2.2 肾脏组织中氧化应激指标的测定 与Con组比较，DN组SOD、GSH-Px和CAT活性显著下降而MDA含量显著升高(P<0.05)。Cur治疗后可升高肾脏SOD、GSH-Px和CAT活性同时降低MDA含量(P<0.05)，结果见表2。

表2 姜黄素对STZ所诱导的糖尿病大鼠肾脏中氧化应激指标的影响±s)

与Con组比较，*P<0.05;与DN组比较，#P<0.05

2.3 肾脏组织中TGF-β1、P62和LC3-Ⅱ的变化 如图1(封二)所示，与Con组比较，DN组大鼠肾脏组织中TGF-β1、P62表达显著增加，LC3-Ⅱ表达显著减少，而DN+Cur组与DN组比较TGF-β1、P62表达减少和LC3-Ⅱ表达增加(P<0.05)。

3 讨 论

Cur是天然药物中的一种，对多种慢性疾病具有有益的影响而没有明显的不良反应。多种机制在DN的发生和发展中起作用，例如：氧化应激、血脂异常、肾血液动力学改变、非酶糖基化蛋白增加、多元醇途径和MAPK信号通路激活。本研究中，DN大鼠肾脏组织SOD、GSH-Px和CAT活性活力显著降低，而MDA含量显著增高，给予Cur治疗后肾脏组织中SOD、GSH-Px和CAT活性活力显著升高，而脂质代谢产物MDA显著下降，显示Cur具有较强的抗氧化能力。DN大鼠血清中BUN、Crea含量显著增多，给予Cur治疗后血清中BUN、Crea含量显著减少，而24h尿蛋白含量与此一致，这表明Cur可能通过抗氧化而产生肾脏保护作用。

在DN的众多发病机制中，自噬引起研究人员的特别关注[4-5]。在哺乳动物细胞中,自噬是受损或额外蛋白质和细胞器降解的分解代谢过程，在维持细胞稳态和完整性中起重要作用。自噬失调与癌症、神经退行性病变、DN和感染性疾病等相关。研究显示在DN的发病过程中自噬受损，在人类疾病中，大量证据显示找到激活和维持自噬的关键靶点具有肾脏保护作用，自噬有望成为阻止或缓和DN的一个潜在靶标[6]。本研究中观察到DN大鼠肾脏组织中P62的表达明显增多,而LC3-Ⅱ的表达明显减少，而Cur治疗后可显著降低P62的表达,而显著升高肾脏LC3-Ⅱ的表达。

DN的特征是细胞肥大、肾脏纤维化过度和纤维蛋白等细胞外基质沉积，随后，TGF-β1刺激DN，触发肾小球和管状基膜增厚，最后导致肾小球硬化和肾纤维化，导致肾功能下降。研究显示Cur使TGF-β1的表达下调，减少细胞外基质的沉积而具有肾脏保护作用[1]。大量研究显示TGF-β1调控自噬,自噬在正常和疾病状态下调控许多与肾脏纤维化相关的重要环节,例如肾小管间质纤维化、肾小球硬化和DN[7]。本研究中，观察到DN大鼠肾脏组织中TGF-β1的表达明显增加，而Cur治疗后可显著减少肾脏TGF-β1的表达。

与许多天然药物一样，Cur可能具有多作用靶点，从而具有治疗许多疾病的作用。本研究显示，Cur对DN大鼠肾脏具有保护作用，其机制可能与抑制氧化应激有关，也可能与TGF-β1调控自噬有关。本研究为寻求开发新的抗糖尿病肾病的药物提供了新的思路。

[1]HUANG J,HUANG K,LAN T,et al.Curcumin ameliorates diabetic nephropathy by inhibiting the activation of the SphK1-S1P signaling pathway[J].Mol Cell Endocrinol,2013,365(2):231

[2]SOETIKNO V,SARI F R,SUKUMARAN V,et al.Curcumin prevents diabetic cardiomyopathy in streptozotocin-induced diabetic rats：possible involvement of PKC-MAPK signaling pathway[J].Eur J Pharm Sci,2012,47(3):604

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[4]USUELLI V,LA ROCCA E.Novel therapeutic approaches for diabetic nephropathy and retinopathy[J].Pharmacol Res,2015,98:39

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Protective Effects of Curcumin on Renal Tissue in Diabetic Nephropathy Rats and its Mechanisms

ZHAO Xin-yuan,LI Dan,KE Zhi-qiang

(DepartmentofMedicine,ClinicMedicalCollegeofHubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Objective To study the protective effects of curcumin (Cur) on renal tissue in diabetic nephropathy rats and its possible mechanisms.Methods SD rats were divided into control group, diabetic model group and DN+Cur 300 mg/(kg·d) group. The model of diabetes was induced with high fat diet and intraperitoneal injection of 35 mg/kg streptozotocin (STZ). Blood glucose level was measured 72 h after STZ injection. After treatment for 16 weeks, the levels of creatinine (Crea) and blood urea nitrogen (BUN) in serum,the contents of malondialdehyde(MDA)，superoxide dismutase(SOD)，the activities of glutathione peroxidase(GSH-Px) and hydrogen peroxidase(CAT) and 24 h urine protein were measured. The protein expression of TGF-β1，p62 and LC3-Ⅱ were detected by Western blotting.Results Curcumin significantly decreased the blood Crea，BUN and 24 h urine protein levels，increased the body weight，inhibited MDA content and elevated GSH-Px，SOD and CAT activities in diabetic rat renal tissue. In addition，curcumin treatment also markedly inhibited the diabetes-induced protein expression of TGF-β1，p62，increased the expression of LC3-Ⅱ.Conclusion Curcumin has protective effect on diabetic nephropathy and the mechanisms may be involved in the regulation of oxidative stress and autophagy.

Diabetic nephropathy;Curcumin;Oxidative stress;TGF-β1；Autophagy

湖北科技学院校级科研项目(ky14068)

R285.5

A

2095-4646(2016)05-0369-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.05.0369

2016-05-31)

**通讯作者，E-mail：kezhiqiang86@163.com