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烟草蛋白酶体α2型亚单位的克隆和序列分析

2016-11-28付强邹颉余婧赵杰宏任学良

江苏农业科学 2016年9期
关键词:蛋白酶体烟草克隆

付强+邹颉+余婧+赵杰宏+任学良

摘要:为研究烟草识别病毒并将其降解为蛋白酶体基因,以拟南芥的蛋白酶体α2型亚单位基因全长cDNA序列(GenBank登录号:AF043520.1)为信息探针,用电子克隆的方法从烟草栽培品种中克隆到1个蛋白酶体基因NtPAB1,并对其进行序列分析。结果表明,NtPAB1包含完整的开放读码框,编码219个氨基酸,含有1个保守域proteasome_alpha_type_2;通过同源比对和进化分析发现,NtPAB1氨基酸序列与葡萄PAB1的序列一致性达到98%。以上结果表明,NtPAB1是栽培烟草中未报道的编码蛋白酶体基因。

关键词:栽培烟草;蛋白酶体α2型亚单位;蛋白降解;克隆;序列分析

中图分类号: S188;S572.01 文献标志码: A

文章编号:1002-1302(2016)09-0039-03

马铃薯Y病毒属的蚜传辅助因子(HC-Pro)是释放感染所需病毒蛋白的三大蛋白酶之一[1],HC-Pro抑制植物体内起抗病毒作用的RNA干涉,但其具体分子机制尚无报道[2-3]。近期研究发现,莴苣花叶病毒的HC-Pro能干涉泛素/26S蛋白酶体系统中核心元件20S蛋白酶体的活性,而泛素/26S蛋白酶体系统参与抗病毒反应[4]。Ballut等研究发现,烟草花叶病毒、莴苣花叶病毒的RNA能够被蛋白酶体识别水解,这暗示20S蛋白酶体的核酸内切酶活性可能参与植物体内的抗病毒过程[5]。

泛素/26S蛋白酶体在植物发育的方方面面起着重要作用,影响着一系列生理过程,包括胚胎发育和衰老[6]。泛素/26S蛋白酶体的核心元件是受到紧密调控并高度特异的26S蛋白酶体,由二级结构为圆柱形的20S核心蛋白酶结合1个19S调控因子构成[7]。筒形的20S蛋白酶体由4个环形结构构成,包括在2个外侧的环形结构中的7个α亚基,而内侧的2个环形结构上具有7个β亚基,其大体的构型为α1-α7/β1-β7//β1-β7/α1-α7/α1-α7[7]。尽管已经从烟草、土豆、绿豆、豌豆等植物中纯化得到20S蛋白酶体[8-10],但是目前尚无关于栽培烟草中蛋白酶体α2型亚单位基因序列的报道。

随着近年来多个物种全基因组测序的完成和表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)计划的发展,电子克隆技术应运而生,其技术核心是利用生物信息学技术组装延伸ESTs序列,获得基因的部分乃至全长cDNA序列。本研究采用电子克隆的方法获得1个蛋白酶体α2型亚单位基因NtPAB1,并对其进行生物信息学分析,为进一步研究烟草中外源蛋白、异常蛋白的降解奠定基础。

1 材料与方法

1.1 烟草PAB1基因的电子克隆

以拟南芥的蛋白酶体α2型亚单位基因全长cDNA序列(GenBank登录号:AF043520.1)为信息探针[11],对GenBank中EST_others数据库指定物种烟草(Nicotiana tabacum)进行Blast比对,并利用菲莫公司林烟草和绒毛状烟草的全基因组测序数据[12],将比对到的烟草栽培品种美国普通烟草的全部EST序列使用Codon Code Aligner软件进行拼接,形成重叠群(contig)。利用拼接获得的重叠群作为探针,再次进行同源检索、拼接,重复以上过程直至没有更多EST被检出,获得普通烟草的PAB1 cDNA序列。最后,再以此片段在NCBI数据中进行BLAST比对,对比其他物种同源基因的相似性和一致性,判断拼接所得cDNA片段的正确性以及读码框(open reading frame,ORF)序列的完整性。

1.2 烟草PAB1基因的生物信息学分析

序列比对、ORF查找和翻译在“http://www.ebi.ac.uk/”提供的相应模块上完成。采用ExPASy网站上Prot-Param、pI/Mw对蛋白质的理化性质进行基本分析;利用在线资源的SignalP 4.1、TargetP1.1、NetPhos、SOPMA软件进行信号肽、磷酸化位点、蛋白的二级结构分析;利用ClustalX2.0、MEGA4.0软件进行氨基酸序列比对和进化树分析。

2 结果与分析

2.1 烟草栽培品种PAB1基因的电子克隆

以拟南芥的蛋白酶体α2型亚单位基因全长cDNA序列为检索探针,对GenBank中烟草EST数据库进行BLAST检索分析,同时比对菲莫公司2013年发布的烟草基因组测序数据[12],发现10条一致性(identity)、相似性(similarity)较高的EST序列。按照“1.1”节所述方法进行重叠群分析,结果显示,10条EST可拼接成1条独立的cDNA序列,长度为660 bp,暂命名NtPAB1(Nicotiana tabacum PAB1)(图1)。

2.2 NtPAB1蛋白基本参数和可能的翻译后修饰

NtPAB1蛋白含有219个氨基酸,分子量为23.71 ku,等电点(pI值)为7.8。NCBI保守域检测表明,NtPAB1蛋白含有1个保守域PROTEASOME_ALPHA_1,说明所克隆的NtPAB1基因是植物蛋白酶体基因家族成员(图2)。蛋白质不稳定指数为34.31,属于不稳定蛋白;脂溶指数为88.08,总平均亲水性为-0.193,具有轻度疏水性。

采用SignalP 4.1[13]预测NtPAB1蛋白无信号肽。利用TargetP1.1[14]在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)对推导蛋白的定位特性分析显示,NtPAB1没有特殊定位偏好性。用NetPhos2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测表明,NtPAB1蛋白存在20个磷酸化位点,其潜在丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Tyr)活性位点数分别为5、3、1个,NtPAB1蛋白存在较多的磷酸化位点,说明磷酸化位点修饰对PAB家族蛋白的活化起着重要作用。

2.3 NtPAB1蛋白的二级结构分析

通过SOPMA方法分析NtPAB1蛋白质的二级结构如图3所示,可见参与α-螺旋的氨基酸含量达到37.90% (83个);63个氨基酸可能参与形成无规则卷曲,占28.77%;另外有49个氨基酸可能参与延伸链,占22.37%;24个氨基酸可能参与β-转角,占10.96%。说明α-螺旋、无规则卷曲是NtPAB1蛋白质的主要结构。

2.4 NtPAB1基因同源性分析和系统进化树分析

为分析NtPAB1与其他植物的蛋白酶体基因的同源性,在NCBI数据库中进行BLASTp。结果表明,NtPAB1所编码的蛋白质的氨基酸序列与葡萄同源基因氨基酸相似性最高,达到98%,而在林烟草和本式烟草中未能找到该基因的同源基因。另外NtPAB1与杨树、百脉根、可可的相关基因的相似性达到85%以上。从GenBank上获得的多个植物PAB同源基因编码蛋白的氨基酸序列,经过ClustalX 2.0比对后生成aln比对文件,然后利用进化分析软件MEGA4.0打开比对文件,采用邻接(Neighbor-Joint,N-J)算法构建系统进化树[15- 16]。分析结果表明,NtPAB1与葡萄PAB基因编码蛋白进化关系更近(图4)。

3 结论与讨论

马铃薯Y病毒属(potato virus Y,PVY)是包含范围广、增殖过程复杂但基因组简单的一类重要病毒,对农业生产造成重大的经济损失[17]。特别是在烟草行业,烟草马铃薯Y病毒分布于世界各烟区。在中国,近年来马铃薯Y病毒也有逐年加重的趋势,在马铃薯、烟草及蔬菜混种或间种的地区发病尤为严重,已经成为导致烟草减产和品质下降的主要病毒之一。国外研究调查显示,烟草感染PVY后,其单位面积产值减少11%~18%,烟叶等级指数也降低36%~62%。

近年来,随着生物技术的发展,发现了许多PVY侵染循环中的作用因子,加深了对PVY侵染过程中各项机制的研究。HC-Pro对于PVY的传播至关重要,但是其具体分子机制尚未研究清楚。Ballut等研究表明,莴苣花叶病毒的HC-Pro能够结合20S蛋白酶体[4]。因此可知,20S蛋白酶体对于植物抵御病毒的危害具有重要作用。

本研究通过电子克隆方法从烟草栽培品种中克隆到1个20S蛋白酶体基因NtPAB1,为利用该基因培育抗PVY病毒栽培烟草品系奠定了理论基础。下一步工作是通过改变烟草20S蛋白酶体的序列,使得PVY病毒的HC-Pro无法识别靶标序列,从而达到抗PVY的目的。

参考文献:

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