烟草蛋白酶体α2型亚单位的克隆和序列分析

付强+邹颉+余婧+赵杰宏+任学良

摘要：为研究烟草识别病毒并将其降解为蛋白酶体基因，以拟南芥的蛋白酶体α2型亚单位基因全长cDNA序列（GenBank登录号：AF043520.1）为信息探针，用电子克隆的方法从烟草栽培品种中克隆到1个蛋白酶体基因NtPAB1，并对其进行序列分析。结果表明，NtPAB1包含完整的开放读码框，编码219个氨基酸，含有1个保守域proteasome_alpha_type_2；通过同源比对和进化分析发现，NtPAB1氨基酸序列与葡萄PAB1的序列一致性达到98%。以上结果表明，NtPAB1是栽培烟草中未报道的编码蛋白酶体基因。

关键词：栽培烟草；蛋白酶体α2型亚单位；蛋白降解；克隆；序列分析

中图分类号： S188；S572.01 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0039-03

马铃薯Y病毒属的蚜传辅助因子（HC-Pro）是释放感染所需病毒蛋白的三大蛋白酶之一[1]，HC-Pro抑制植物体内起抗病毒作用的RNA干涉，但其具体分子机制尚无报道[2-3]。近期研究发现，莴苣花叶病毒的HC-Pro能干涉泛素/26S蛋白酶体系统中核心元件20S蛋白酶体的活性，而泛素/26S蛋白酶体系统参与抗病毒反应[4]。Ballut等研究发现，烟草花叶病毒、莴苣花叶病毒的RNA能够被蛋白酶体识别水解，这暗示20S蛋白酶体的核酸内切酶活性可能参与植物体内的抗病毒过程[5]。

泛素/26S蛋白酶体在植物发育的方方面面起着重要作用，影响着一系列生理过程，包括胚胎发育和衰老[6]。泛素/26S蛋白酶体的核心元件是受到紧密调控并高度特异的26S蛋白酶体，由二级结构为圆柱形的20S核心蛋白酶结合1个19S调控因子构成[7]。筒形的20S蛋白酶体由4个环形结构构成，包括在2个外侧的环形结构中的7个α亚基，而内侧的2个环形结构上具有7个β亚基，其大体的构型为α1-α7/β1-β7//β1-β7/α1-α7/α1-α7[7]。尽管已经从烟草、土豆、绿豆、豌豆等植物中纯化得到20S蛋白酶体[8-10]，但是目前尚无关于栽培烟草中蛋白酶体α2型亚单位基因序列的报道。

随着近年来多个物种全基因组测序的完成和表达序列标签（expressed sequence tags，ESTs）计划的发展，电子克隆技术应运而生，其技术核心是利用生物信息学技术组装延伸ESTs序列，获得基因的部分乃至全长cDNA序列。本研究采用电子克隆的方法获得1个蛋白酶体α2型亚单位基因NtPAB1，并对其进行生物信息学分析，为进一步研究烟草中外源蛋白、异常蛋白的降解奠定基础。

1 材料与方法

1.1 烟草PAB1基因的电子克隆

以拟南芥的蛋白酶体α2型亚单位基因全长cDNA序列（GenBank登录号：AF043520.1）为信息探针[11]，对GenBank中EST_others数据库指定物种烟草（Nicotiana tabacum）进行Blast比对，并利用菲莫公司林烟草和绒毛状烟草的全基因组测序数据[12]，将比对到的烟草栽培品种美国普通烟草的全部EST序列使用Codon Code Aligner软件进行拼接，形成重叠群（contig）。利用拼接获得的重叠群作为探针，再次进行同源检索、拼接，重复以上过程直至没有更多EST被检出，获得普通烟草的PAB1 cDNA序列。最后，再以此片段在NCBI数据中进行BLAST比对，对比其他物种同源基因的相似性和一致性，判断拼接所得cDNA片段的正确性以及读码框（open reading frame，ORF）序列的完整性。

1.2 烟草PAB1基因的生物信息学分析

序列比对、ORF查找和翻译在“http：//www.ebi.ac.uk/”提供的相应模块上完成。采用ExPASy网站上Prot-Param、pI/Mw对蛋白质的理化性质进行基本分析；利用在线资源的SignalP 4.1、TargetP1.1、NetPhos、SOPMA软件进行信号肽、磷酸化位点、蛋白的二级结构分析；利用ClustalX2.0、MEGA4.0软件进行氨基酸序列比对和进化树分析。

2 结果与分析

2.1 烟草栽培品种PAB1基因的电子克隆

以拟南芥的蛋白酶体α2型亚单位基因全长cDNA序列为检索探针，对GenBank中烟草EST数据库进行BLAST检索分析，同时比对菲莫公司2013年发布的烟草基因组测序数据[12]，发现10条一致性（identity）、相似性（similarity）较高的EST序列。按照“1.1”节所述方法进行重叠群分析，结果显示，10条EST可拼接成1条独立的cDNA序列，长度为660 bp，暂命名NtPAB1（Nicotiana tabacum PAB1）（图1）。

2.2 NtPAB1蛋白基本参数和可能的翻译后修饰

NtPAB1蛋白含有219个氨基酸，分子量为23.71 ku，等电点（pI值）为7.8。NCBI保守域检测表明，NtPAB1蛋白含有1个保守域PROTEASOME_ALPHA_1，说明所克隆的NtPAB1基因是植物蛋白酶体基因家族成员（图2）。蛋白质不稳定指数为34.31，属于不稳定蛋白；脂溶指数为88.08，总平均亲水性为-0.193，具有轻度疏水性。

采用SignalP 4.1[13]预测NtPAB1蛋白无信号肽。利用TargetP1.1[14]在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）对推导蛋白的定位特性分析显示，NtPAB1没有特殊定位偏好性。用NetPhos2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测表明，NtPAB1蛋白存在20个磷酸化位点，其潜在丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Tyr）活性位点数分别为5、3、1个，NtPAB1蛋白存在较多的磷酸化位点，说明磷酸化位点修饰对PAB家族蛋白的活化起着重要作用。

2.3 NtPAB1蛋白的二级结构分析

通过SOPMA方法分析NtPAB1蛋白质的二级结构如图3所示，可见参与α-螺旋的氨基酸含量达到37.90% （83个）；63个氨基酸可能参与形成无规则卷曲，占28.77%；另外有49个氨基酸可能参与延伸链，占22.37%；24个氨基酸可能参与β-转角，占10.96%。说明α-螺旋、无规则卷曲是NtPAB1蛋白质的主要结构。

2.4 NtPAB1基因同源性分析和系统进化树分析

为分析NtPAB1与其他植物的蛋白酶体基因的同源性，在NCBI数据库中进行BLASTp。结果表明，NtPAB1所编码的蛋白质的氨基酸序列与葡萄同源基因氨基酸相似性最高，达到98%，而在林烟草和本式烟草中未能找到该基因的同源基因。另外NtPAB1与杨树、百脉根、可可的相关基因的相似性达到85%以上。从GenBank上获得的多个植物PAB同源基因编码蛋白的氨基酸序列，经过ClustalX 2.0比对后生成aln比对文件，然后利用进化分析软件MEGA4.0打开比对文件，采用邻接（Neighbor-Joint，N-J）算法构建系统进化树[15- 16]。分析结果表明，NtPAB1与葡萄PAB基因编码蛋白进化关系更近（图4）。

3 结论与讨论

马铃薯Y病毒属（potato virus Y，PVY）是包含范围广、增殖过程复杂但基因组简单的一类重要病毒，对农业生产造成重大的经济损失[17]。特别是在烟草行业，烟草马铃薯Y病毒分布于世界各烟区。在中国，近年来马铃薯Y病毒也有逐年加重的趋势，在马铃薯、烟草及蔬菜混种或间种的地区发病尤为严重，已经成为导致烟草减产和品质下降的主要病毒之一。国外研究调查显示，烟草感染PVY后，其单位面积产值减少11%～18%，烟叶等级指数也降低36%～62%。

近年来，随着生物技术的发展，发现了许多PVY侵染循环中的作用因子，加深了对PVY侵染过程中各项机制的研究。HC-Pro对于PVY的传播至关重要，但是其具体分子机制尚未研究清楚。Ballut等研究表明，莴苣花叶病毒的HC-Pro能够结合20S蛋白酶体[4]。因此可知，20S蛋白酶体对于植物抵御病毒的危害具有重要作用。

本研究通过电子克隆方法从烟草栽培品种中克隆到1个20S蛋白酶体基因NtPAB1，为利用该基因培育抗PVY病毒栽培烟草品系奠定了理论基础。下一步工作是通过改变烟草20S蛋白酶体的序列，使得PVY病毒的HC-Pro无法识别靶标序列，从而达到抗PVY的目的。

参考文献：

[1]Plisson C，Drucker M，Blanc S，et al. Structural characterization ofHC-Pro，a plant virus multifunctional protein[J]. The Journal ofBiological Chemistry，2003，278（26）：23753-23761.

[2]Anandalakshmi R，Pruss G J，Ge X，et al. A viral suppressor of gene silencing in plants[J]. Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，1998，95（22）：13079-13084.

[3]Brigneti G，Voinnet O，Li W X，et al. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana[J]. The EMBO Journal，1998，17（22）：6739-6746.

[4]Ballut L，Drucker M，Pugnière M，et al. HcPro，a multifunctional protein encoded by a plant RNA virus，targets the 20S proteasome and affects its enzymic activities[J]. The Journal of General Virology，2005，86（9）：2595-2603.

[5]Ballut L，Petit F，Mouzeyar S，et al. Biochemical identification ofproteasome-associated endonuclease activity in sunflower[J].Biochimica et Biophysica acta，2003，1645（1）：30-39.

[6]Hellmann H，Estelle M. Plant development：Regulation by protein degradation[J]. Science，2002，297（5582）：793-797.

[7]Vierstra R D. Proteolysis in plants：mechanisms and functions[J]. Plant Molecular Biology，1996，32（1/2）：275-302.

[8]Schliephacke M，Kremp A，Schmid H P，et al. Prosomes （proteasomes） of higher plants[J]. European Journal of Cell Biology，1991，55（1）：114-121.[HJ1.73mm]

[9]Kremp A，Schliephacke M，Kull U，et al. Prosomes exist in plant cells too[J]. Experimental Cell Research，1986，166（2）：553-557.

[10]Skoda B，Malek L. Dry pea seed proteasome：purification and enzymic activities[J]. Plant Physiology，1992，99（4）：1515-1519.

[11]Fu H，Doelling J H，Arendt C S，et al. Molecular organization of the 20S proteasome gene family from Arabidopsis thaliana[J].Genetics，1998，149（2）：677-692.

[12]Sierro N，Battey J N，Ouadi S，et al. Reference genomes and transcriptomes of Nicotiana sylvestris and Nicotiana tomentosiformis[J]. Genome Biology，2013，14（6）：R60.

[13]Petersen T N，Brunak S，von Heijne G，et al. SignalP 4.0：discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nature Methods，2011，8（10）：785-786.

[14]Emanuelsson O，Brunak S，von Heijne G，et al. Locating proteins in the cell using TargetP，SignalP and related tools[J]. NatureProtocols，2007，2（4）：953-971.

[15]Saitou N，Nei M. The neighbor-joining method：a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology andEvolution，1987，4（4）：406-425.

[16]Tamura K，Dudley J，Nei M，et al. MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis （MEGA） software version 4.0[J]. MolecularBiology and Evolution，2007，24（8）：1596-1599.

[17]李萌萌，陈士华，吴兴泉. 马铃薯块茎坏死环斑病研究进展[J]. 江苏农业科学，2015，43（4）：143-146.