加味生脉补心丹对防治2型糖尿病大鼠心肌损害的影响

陈青扬，黄惠勇*，刘卜菡，曾光，潘继兴

（湖南中医药大学中医诊断，湖南长沙410208）

·方药研究·

加味生脉补心丹对防治2型糖尿病大鼠心肌损害的影响

陈青扬，黄惠勇*，刘卜菡，曾光，潘继兴

（湖南中医药大学中医诊断，湖南长沙410208）

目的观察加味生脉补心丹对2型糖尿病大鼠模型血糖及心肌组织结构的影响，初步探讨加味生脉补心丹对糖尿病心肌纤维化和肥大的防治作用。方法40只SD大鼠随机分为空白组7只，实验组33只，通过高糖高脂饲料+小剂量STZ构建2型糖尿病大鼠模型。将成模后的实验组大鼠随机分为模型组、补心丹（BXD）组和罗格列酮（RSG）组各11只，BXD组以浓缩后加味生脉补心丹汤剂灌胃；RSG组按照罗格列酮钠溶液灌胃。给药8周后测各组大鼠空腹血糖，并处死取材，光镜观察心肌组织变化，Masson染色观察纤维沉积情况，免疫组化法观察Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和沉默信息调节因子3（Sirt3）蛋白的表达。结果成模时各实验组空腹血糖（FPG）均较空白组升高（P＜0.05），造模成功。治疗完成时，RSG组、BXD组FPG均较模型组下降（P＜0.05），RSG组FPG较BXD组更低（P＜0.05）。模型组心肌组织破坏严重，胶原纤维含量增多，RSG组和BXD组心肌组织破坏程度较轻，胶原纤维含量较少。模型组Ⅰ、Ⅲ型胶原和Sirt3的表达明显高于其他组（P＜0.05）。BXD组Ⅲ型胶原的表达明显高于空白组（P＜0.05）。RSG组Sirt3的表达显著高于BXD组（P＜0.05）。结论加味生脉补心丹能够明显降低2型糖尿病大鼠的血糖，并能够明显减轻心肌纤维化、肥大的程度，延缓糖尿病所致心肌病的进程。

加味生脉补心丹；2型糖尿病；Ⅰ型胶原蛋白；Ⅲ型胶原蛋白；沉默信息调节因子3；心肌损害；太子参；黄芪

2型糖尿病是一种以胰岛素抵抗为主的有多种并发症的代谢性疾病，其中糖尿病心肌病是其主要并发症之一，临床表现以左室舒张（或）收缩功能障碍为主。心肌纤维化是糖尿病心肌病的重要特征性病理改变，随着病情的进展会导致心功能减退、心脏扩大和各种心律失常。研究认为，胶原纤维的大量沉积是糖尿病心肌病心肌纤维化的重要致病因素[1]。胶原纤维在心肌细胞外基质的大量沉积将增加心室壁的僵硬度，减低心室的顺应性从而导致心室的收缩与舒张功能不全。沉默信息调节因子3（Sirt3）能够保护心肌细胞减少由于氧化应激导致的损伤，从而延缓心肌肥厚导致的心功能恶化的进程[2-3]。本文通过建立2型糖尿病大鼠模型，观察大鼠心肌组织的病理改变、Masson染色改变以及Ⅰ、Ⅲ型胶原与Sirt3蛋白表达水平的改变，探讨加味生脉补心丹在早期治疗2型糖尿病的同时，对心肌组织的保护作用和预防作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物健康雄性SPF级SD大鼠，5周龄，40只，体质量（150±20）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCKX（湘）2011-0003。

1.1.2 饲料配方普通饲料：由湖南中医药大学实验动物中心提供。供给空白组。高糖高脂饲料配方如下：蔗糖15%，胆固醇4%，胆酸钠0.3%，猪油10%，蛋黄粉10%，基础膳食60.7%，混合、搅拌均匀，加水适量，塑形，烤箱烘干，由湖南中医药大学实验动物中心加工。供给除空白组外的其他组。

1.1.3 药物加味生脉补心丹：方剂来源于《内外伤辨惑论》卷中方和《摄生秘剖》卷一方加减：太子参10 g，丹参15 g，生地黄15 g，天花粉12 g，黄芪20 g，茯苓8 g，炙甘草6 g。饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院，加水煎煮2次，合并煎液，分别离心过滤，浓缩至含生药2 g/mL，灭菌后于4℃冰箱保存备用。罗格列酮钠片，规格4 mg/片，太极集团重庆涪陵制药厂有限公司。取罗格列酮研碎成粉末，溶于双蒸水中。

1.1.4 主要试剂二步法试剂盒（中山金桥有限公司），DAB试剂盒（中山金桥有限公司），CollagenⅠ一抗（CST公司，货号：14695-AP），CollagenⅢ一抗（Proteintech公司，货号：135548-1-AP），Sirt3一抗（Abcam公司，货号：10099-1-AP）。

1.2 方法

1.2.1 造模根据国内外常用2型糖尿病大鼠制备方法，即高糖高脂饲料+小剂量STZ诱导法改良的高糖高脂饲料+小剂量STZ体质量联合体表面积法构建2型糖尿病大鼠模型[4]。将40只SD大鼠随机分为7只空白组，33只实验组，空白组给予普通饲料，实验组予以高糖高脂饲料。所有大鼠均饲养于在自由饮食、分笼饲养，自由饮水饮食，温度（20± 3）℃、背景噪音为（40±10）db、光/暗周期为12 h/ 12 h的条件下。喂养4周后，从第5周开始实验组以mg/（kg+m2）法计算出的剂量腹腔注射STZ：体质量≤200 g的部分：按25 mg/kg计算STZ量；体质量＞200 g部分：按162.45 mg/m2[体表面积=大鼠体型系数（0.09）×体质量2/3]计算，二者相加即为1次STZ的注射剂量。间隔2 d后，再予以同样的方法注射STZ。空白组则给予2次腹腔注射等容积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。最后一次注射STZ后的第6 d，禁食12 h尾端测空腹血糖，以2次空腹血糖＞11.1 mmol/L为2型糖尿病大鼠成模标准。

1.2.2 分组将造模成功的33只实验组大鼠随机分为：模型对照组（简称模型组）11只，罗格列酮钠组（简称RSG组）11只，加味生脉补心丹组（简称BXD组）11只。

1.2.3 动物给药造模成功后第2天，BXD组以浓缩后加味生脉补心丹汤剂10 mL/（kg·d）灌胃，相当于20 g/（kg·d）生药；RSG组按照罗格列酮钠溶液10 mL/（kg·d）予以灌胃。空白组和模型组每天以相同体积的生理盐水灌胃。每天灌胃给药1次，时间为9：00～11：00 a.m，持续给药8周。

1.3 标本收集与指标检测

1.3.1 外观表征实验期间观察并记录造模中各组大鼠体质量、进食量、尿量、毛发情况、活动及精神状态、垫料、大便等一般指标。

1.3.2 空腹血糖检测最后一次注射STZ后的第6 d，各组大鼠禁食12 h后，在非麻醉情况下剪尾取血测空腹血糖值，观察药物对大鼠空腹血糖的影响。

因此，电磁编码器电路的输出信号和码盘的旋转是紧密相连的。通过测定输出信号的周期数或周期时间就可知道磁鼓的位置和旋转速度。电磁旋转编码器结构示意如图4所示。

1.3.3 心肌组织光镜观察各组大鼠，隔夜禁食12 h后称重，分别进行断尾釆血，即时测定空腹血

糖并予以记录。随后各组大鼠被腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）以麻醉。麻醉成功后，快速打开胸腔切除心脏，去除包膜，剪取心肌组织置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，经过脱水、包埋，制成切片，分别进行HE和Masson染色处理。封片后于光镜下观察心肌组织病理形态学改变及胶原沉积情况。

1.3.4 检测胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ与Sirt3的表达将心肌组织切片通过免疫组化法分别作Ⅰ、Ⅲ型胶原以及Sirt3染色。经Image-Pro Plus图像分析软件随机取3个视野分析光密度，判定1、3型胶原蛋白和Sirt3的表达。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般生存状况

注射STZ后，与空白组相比，实验组大鼠活动明显减少，日平均消耗饲料量、饮水量、尿量增加，垫料气味甜腻，毛发发黄、易脱落，精神萎靡，尾部潮湿。随治疗的进行，RSG组和BXD组大鼠一般状况逐渐改善。实验过程中，因灌胃损伤、炎症等因素，模型组死亡1只，RSG组死亡1只。最后各组大鼠数目为：空白组7只，模型组10只，RSG组10只，BXD组11只。

2.2 大鼠空腹血糖变化情况

各组大鼠FPG检测结果：实验前各组大鼠血糖正常，各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。成模时，各实验组FPG均升高（P＜0.05），达到糖尿病诊断标准。各实验组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗完成时，各实验组均较空白组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。RSG组、BXD组均较模型组下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。RSG组FPG较BXD组更低，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明罗格列酮和加味生脉补心丹均具有较好的降糖效果，其中加味生脉补心丹降糖效果略逊于罗格列酮。结果见表1。

2.3 心肌组织病理学改变与胶原沉积情况

大鼠心肌HE染色切片显示，空白组心肌细胞排列整齐、核染色清晰。模型组心肌细胞肥大变性，排列紊乱，虽无明显坏死灶，但部分细胞染色加深，横纹消失，纤维肿胀。BXD组和RSG组心肌细胞亦不紧密，稍紊乱，核染色基本清晰，部分细胞染色不均匀，纤维肿胀，与模型组相比程度较轻。结果见图1。

表1 各组各时期空腹血糖的比较（±s，mmol/L）

表1 各组各时期空腹血糖的比较（±s，mmol/L）

注：与空白组比较*P＜0.05，与模型组比较#P＜0.05，与BXD组比较△P＜0.05。

组别空白组模型组BXD组RSG组n 7 1 0 10 11 F P实验前3.87±0.33 3.90±2.78 3.76±0.21 3.29±023 0.254 0.858成模时4.08±056 16.61±2.05* 17.68±2.53* 16.85±2.73* 49.349 0.00治疗完成时3.86±0.39 11.61±0.85* 7.15±0.69*#5.24±1.15*#△77.824 0.00

图1 各组大鼠心肌组织光镜观察图（HE染色，×400）

Masson染色切片结果显示，空白组胶原纤维网规则，胶原纤维含量少。模型组细胞间质纤维变粗、增加，围绕心肌细胞的胶原纤维网断裂、排列紊乱，间质纤维化明显。BXD组和RSG组胶原组织排列较模型组规整，亦有不同程度纤维化，与模型组相比较轻。结果见图2。

图2 各组大鼠心肌组织光镜观察图（Masson染色，×400）

2.4 Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和Sirt3蛋白平均光密度结果

Ⅰ型胶原模型组明显高于其他组，差异有统计学意义（P＜0.05）。RSG组、空白组、BXD组之间，差异无统计学意义（P＞0.05）。Ⅲ型胶原模型组与其他组，差异有统计学意义（P＜0.05）。RSG组与BXD组、空白组，差异无统计学意义（P＞0.05）。Sirt3模型组与其他组，差异有统计学意义（P＜0.05）。空白组与RSG组、BXD组，差异无统计学意义（P＞0.05）。RSG组与BXD组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达量（±s，g）

表2 各组大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达量（±s，g）

注：与空白组比较*P＜0.05，与模型组比较#P＜0.05，与BXD组比较△P＜0.05。

组别空白组模型组BXD组RSG组n 7 1 0 10 11 F P / /Ⅰ型胶原0.0074±0.0043 0.0611±0.0047* 0.0112±0.0032#0.0125±0.0033#4.229 0.013Ⅲ型胶原0.0088±0.0017 0.0300±0.0054* 0.0142±0.0038#0.0137±0.0037#11.511 0.00 Sirt3 0.0125±0.0033 0.0236±0.0049* 0.0101±0.0027#0.0165±0.0030#△5.501 0.04

3 讨论

糖尿病在中医学属消渴病，最早记载于《黄帝内经》，是一种以多饮、多食、多尿、身体消瘦为主要临床症状的慢性病。防治或延缓并发症的发生是糖尿病的主要治疗目标之一，与中医“治未病”的理念相契合。加味生脉补心丹，由《内外伤辨惑论》卷中方生脉散和《摄生秘剖》卷一方补心丹两方化裁而来，是湖南中医药大学第一附属医院应用十余年的经验方[5]。本方心肾同治，阴阳兼顾，共奏滋阴清热、补脾益气、活血化瘀、升清降糖之功效。将此方应用于早期2型糖尿病及其心血管并发症的防治也是中医“治未病”思想的体现[6]。

本研究旨在探索加味生脉补心丹对2型糖尿病及其并发的早期心肌纤维化的影响。2型糖尿病的发病原因十分复杂，采用高糖高脂饲料喂养与腹腔注射STZ复合因素造模可以较好地模拟其病理机制。大剂量STZ可引起胰岛细胞的广泛破坏而造成1型糖尿病，而小剂量STZ破坏一部分胰岛细胞的功能，配合高糖高脂饮食喂养下的依赖高胰岛素水平状态，造成外周组织对胰岛素不敏感，从而引起糖尿病[7]。此方法与2型糖尿病发病机制相似，且接近人类2型糖尿病的生理和病理特点[8]。由实验结果可见，加味生脉补心丹对糖尿病多饮、多食等症状均能起缓解作用，且有一定降糖效果，但不如罗格列酮。从光镜下的HE、MASSON染色切片中可见本方对心肌有明显的保护作用，纤维化程度明显得到缓解。由Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达结果可知本方与罗格列酮均有的防心肌纤维化作用。其中罗格列酮主要是通过控制血糖来实现，而本方的降糖作用不如前者，却有着与其相当的护心作用，有理由认为本方还有其他途径达到这一效果。有研究认为心肌细胞肥大、运动与压力的超负荷可造成Sirt3表达的代偿性增高[9-10]。根据Sirt3蛋白表达结果，我们可以推测本方还可以通过改善心肌代谢达到护心、防纤维化的作用。

综上所述，加味生脉补心丹对2型糖尿病大鼠有良好的降糖、护心作用。有可能是在降糖与改善心肌代谢的协同作用下实现延缓心肌纤维化效果。本实验明确了加味生脉补心丹的疗效，并为后续研究其作用机制开拓了思路。

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（本文编辑杨瑛）

Therapeutic Effect of Modified Shengmai Buxin Pills on the Myocardial Damage in Type 2 Diabetes Rats

CHEN Qingyang,HUANG Huiyong*,LIU Bohan,ZENG Guang,PAN Jixing
(Institute of TCM Diagnosis,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To observe the effect of modified Shengmai Buxin pills on the FPG and myocardial structure in type 2 diabetes rats，and preliminary investigate the therapeutic effect on myocardial fibrosis and hypertrophy.Methods 40 SD ratswererandomlydistributedintotheblankgroupwith7ratsandexperimentalgroupwith33rats.Thetype 2 diabetes models were established by feeding the animals with high-fat and high-sucrose diet.The establisged model rats in experimental group were randomly divided into the model group，Buxindan group（BXD）and rosiglitazone group（RSG）group，11 rats in each group.The BXD group was given concentrated modified Shengmai Buxindan decoction by gavage and the RSG group was with rosiglitazone sodium.After 8 weeks，FPG of rats was measured and excuted for heart sample.The changes of myocardial tissue were observed.The fibrous deposition was observed by masson method.The expression of collagen I/III and silent information regulator-3（Sirt3）was determined by immunohistochemical method.Results The FPG of experimentalgroupwashigherthannormalgroup（P＜0.05）.TheFPGofRSGgroupandBXDgroupwashigher than model group（P＜0.05）.The FPG of RSG group was lower than BXD group（P＜0.05）.The myocardial structure of model group was severely damaged and collagen fiber content increased obviously.The damage of the myocardial structure was slighter and the content of collagen was lower in RSG group and BXD group.Compared with the model group，the expression level of collagen I/III and SIRT3 were decreased significantly（P＜0.05）in the other groups.Compared with the normal group，the expression level of collagen III was increased significantly（P＜0.05）in the BXD group.The expression level of Sirt3 in RSG group was increased significantly than the RSG group（P＜0.05）.Conclusion The modified Shengmai Buxin pillscansignificantlydecreasethelevelofbloodsugarintype2diabetesrats.Itcanalleviatethedegree of myocardial fibrosis and hypertrophy，and delay the progression of diabetic cardiomyopathy.

modified Shengmai Buxin pills；type 2 diabetes；collagen I；collagen III；silent information regulator-3；myocardial damage；Radix Pseudostellariae；Astragalus membranaceus

R285.5；R587.1

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.03.002

2015-12-17

国家自然科学基金（81373551）；教育部博士点博士导师基金（2013432311001）；湖南省科技厅重点项目（S2014S2032）；中医诊断国家重点学科开放基金（2013ZYZD04，2013ZYZD27，2014ZYZD05，2014ZYZD28）

陈青扬，男，在读硕士研究生，研究方向：心血管疾病的中医辨治。

黄惠勇，男，教授，博士研究生导师，E-mail：tony27000@aliyun.com。