3种染色法检测奶山羊乳房炎阳性乳汁中体细胞比较研究

陈晓丽，林炜明

（龙岩学院生命科学学院，福建省家畜疫病防治与生物技术重点实验室，龙岩 364000）

疾病防控

3种染色法检测奶山羊乳房炎阳性乳汁中体细胞比较研究

陈晓丽，林炜明

（龙岩学院生命科学学院，福建省家畜疫病防治与生物技术重点实验室，龙岩 364000）

试验探讨3种方法在奶山羊隐性乳房炎乳汁体细胞染色过程中的优缺点，为奶山羊乳房炎体细胞检测提供最合适的染色方法。从某羊场无菌采集100份羊乳，用加利福尼亚乳房炎检测法（CMT）筛选出20份患乳房炎并且未经抗生素治疗的奶山羊乳样，分别采用Diff-Quik染色法、亚甲基蓝染色法和姬姆萨染色法3种方法进行染色，光学显微镜下观察。结果表明：亚甲基蓝染色法操作简单，对细胞质和细胞核染色效果好，但染色时间较长，颜色单一，不利于对粒细胞进行辨别分类；姬姆萨染色法操作简单、易控制，对细胞核染色效果好，易区分各类体细胞，但染色时间长，乳膜易随染液脱落；Diff-Quik染色法操作步骤简单，染色时间短，体细胞对染液的着色亲和，细胞核与细胞质界限分明，嗜酸碱性粒细胞易于区分。说明Diff-Quik染色法优于其他两种染色法，更适合用于奶山羊隐性乳房炎的临床检验。

隐性乳房炎；体细胞检测；Diff-Quik染色法；亚甲基蓝染色法；姬姆萨染色法

在乳制品中，羊奶是最接近母乳、营养成分最全、最易被人体吸收的奶品［1］，与牛乳相比，羊乳含有丰富的免疫球蛋白和维生素A等，可有效提高免疫力，有利于保护视力及预防近视。但羊乳产出量较低，在养殖过程中常受到外伤、厩舍卫生不良、挤奶不规范、奶羊内激素分泌不协调及产后其他疾病诱发等因素而导致乳房炎，造成重大经济损失［2］。体细胞检测对乳腺炎的监控和原料奶的质量控制有重要意义。

羊乳房炎是羊的乳腺、乳池、乳头的局部炎症，多见于绵羊、山羊的泌乳期。当羊患乳房炎时，其乳房发生红、肿、热、痛及泌乳障碍等炎性反应，是动物自卫的一种重要手段。这个过程会升高血液中免疫蛋白质的浓度以及乳腺组织和乳中的白细胞数量［3］。当奶山羊管理得当、营养充足时，机体可以通过提高自身免疫力和排出乳汁来净化乳房内的病原微生物［4］，从而消除乳房中的炎症反应。但若发生护理不当、营养不足等情况时，可能使奶山羊免疫力下降，潜在隐性乳房炎转变成临床型乳房炎［5-6］，不仅乳汁中白细胞会增加，血液中白细胞也会大量增加。

本实验采用Diff-Quik染色法、亚甲基蓝染色法和姬姆萨染色法对奶山羊隐性乳房炎乳汁进行涂片染色观察，根据体细胞染色后界限清晰度及不同细胞在不同染液中的形态结构易分辨程度，探讨羊乳房炎乳汁中体细胞组织形态学的研究方法，为羊乳房炎体细胞检测提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 乳样采集 从福建龙岩某羊场中采集100只奶山羊乳样，每只各采集1份乳样，每份4 mL，采样前先用温水清洗乳房，后用0.1%新洁尔灭对乳头消毒，弃去前3把奶。采集的乳样放入5 mL灭菌EP管中，封口，立即送到实验室进行检测并于当天检验完毕。

1.1.2 试验试剂 加利福尼亚乳房炎检测试剂（CMT），购自福州佳宸生物科技有限公司；Diff-Quik染液，购于南京建成科技有限公司；亚甲基蓝染色液，购自北京索莱宝科技有限公司；姬姆萨染液，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 加利福尼亚乳房炎检测法（CMT） 先将待检乳样2 mL放于塑料乳房炎检验盘中，再加入检测试剂2 mL，缓慢做同心圆状搅拌10 s，观察判定。筛选出20份阳性奶山羊乳样，进行上述乳涂片制作。判定标准见表1。

1.2.2 奶山羊乳汁涂片的制备 用加利福尼亚乳房炎检测试剂对100份奶山羊乳样进行检测，筛选出20份患乳房炎（阳性）并且未经抗生素治疗的奶山羊乳样，按常规方法制成乳涂片并做好标记，分为A、B、C三组，每组各有20份相同乳涂片，如：乳样1，制作A1、B1、C1乳涂片；乳样2，制作A2、B2、C2乳涂片；乳样3，制作A3、B3、C3乳涂片，以此类推，最后，A1、A2、A3到A20为A组，B1、B2、B3到B20为B组，C1、C2、C3到C20为C组。载玻片用2%盐酸浸泡6 h，流水冲洗后，蒸馏水冲洗4～5次，晾干备用。将装在试管中的待测样品摇匀，取2 mL装入刻度离心管中，以2 000 r/min离心，仔细吸除上清液及管壁上的脂肪，将剩余的液体与沉淀混合，然后用微量移液器吸取一定体积的待测鲜乳（标准是0.01 mL），涂抹在载玻片一定面积上（1 cm2）形成均匀样膜，水平放置于37℃烘干箱中干燥5 min，备用。

表1 加利福尼亚乳房炎检测法结果判定标准

1.2.3 亚甲基蓝染色法 将A组烘干的乳涂片置于二甲苯中脱脂2 min后，用吸水纸吸除多余液体，加入美蓝染液染色15～20min，用自来水缓慢流洗染色液，吸取多余的染液后自然晾干，在显微镜下对染色细胞进行观察。

1.2.4 Diff-Quik染色法 Diff-Quik染液由3个试剂组成，分别为试剂1、试剂2、试剂3。将B组乳涂片完全干燥后依次放入试剂1中固定5～10s立即取出，甩掉多余液体，直接放入试剂2中，为了使染液均匀分布，在染色中应上下提动玻片2～3次。染色5～10s后，立即取出，用吸水纸吸除多余液体，直接放入试剂3中染色5～10 s，上下提动玻片2～3次使染液均匀分布，取出涂片放入清水中洗去多余的染液，无水乙醇脱水2次，待干后透明、封片、镜检。

1.2.5 姬姆萨染色法 染色前按姆萨浓缩液1 mL配姬姆萨稀释液9 mL的比例充分混匀后备用，将C组乳涂片完全干燥后，用甲醇固定2～3 min。将乳涂片放置染色架上，滴加稀释好的染色液使其覆盖全部乳膜，室温染色15～30 min，用自来水缓慢从玻片一端冲洗（注意勿先倒去染液或直接对乳膜冲洗），晾干后镜检。

1.3 细胞形态观察

将3种特殊染色法染色后的乳涂片置于显微镜下，观察并采集图像。

2 结果与分析

2.1 亚甲基蓝染色法

亚甲基蓝染色后乳涂片中体细胞的细胞核呈深蓝色，细胞质呈半透明样，细胞核与细胞质的界面清晰，易于区分。染色后切片细胞着色单一，虽可看到形状各异的细胞核，但无法精确区分出细胞种类，只能通过观察细胞核的大小、数量进行初步推测。通过显微观察可以看出，巨噬细胞体积较大，有一被染成深蓝色的肾形细胞核，由于胞浆略嗜碱性，细胞质被染成蓝灰色；淋巴细胞细胞核相对较大，细胞质极少，核深染，核周围浅染，胞质浅蓝色；嗜性粒细胞只能通过其显微形态、大小进行初步判断，无法精确判断具体为何种嗜性粒细胞。详见图1 A。

2.2 Diff-Quik染色法

Diff-Quik染色后乳涂片中着色的体细胞色彩深浅适度，红蓝对比鲜明，各种细胞着色清晰，在显微镜下可清晰看到被染成紫红色的嗜酸性粒细胞、深蓝色的嗜碱性粒细胞、淡紫色的嗜中性粒细胞及单核肥大的巨噬细胞和细胞质极少的淋巴细胞。可通过被染色后细胞含颗粒物质的酸碱性及染色后细胞核的形态、大小以及细胞核和细胞质所呈现的不同颜色和形状加以判断，从而得以区分多种细胞的种类。详见图1 B。

2.3 姬姆萨染色法

姬姆萨染色后乳涂片中细胞核与细胞质的着色界限明显，可在显微镜中清晰看到被染成深色的细胞核和透明的细胞质，细胞轻度偏向深蓝色，红蓝对比模棱两可，导致很难区分嗜酸性和嗜碱性细胞，但仍可从其不同的着色情况及细胞核和细胞质的形状、大小中辨别出深紫色的嗜酸性粒细胞、深蓝色的嗜碱性粒细胞、淡紫色的嗜中性粒细胞及核大深染的淋巴细胞和体积较大的多核巨噬细胞。详见图1 C。

图1 奶山羊乳房炎乳汁体细胞3种染色法形态观察（100×）

3 讨论

亚甲基蓝染色法是一种色素还原试验，体细胞的细胞核可被亚甲基蓝清晰染色［7］。该法是牛奶中体细胞数检测的基准方法，所需仪器设备少，但所用的试剂（四氯乙烷）具有强毒性。伍伟平等［8］实验证明，四氯乙烷在氯代烃类化合物中毒性较大，可通过吸入、食入或经皮肤吸收3种途径导致人体中毒，对中枢神经系统以及肝、肾和心肌造成损害。考虑到本试验耗时较长及其毒性作用，现在乳品生产企业普遍不采用该方法。

Diff-Quik染色法也称为改良Wright染色法，可用于动物血涂片、精子涂片、宫颈刮片、胸腹水细胞涂片等染色［9-11］。将该法运用于乳房炎乳汁体细胞涂片染色的检测，目前尚未见报道，故笔者对Diff-Quik染色法在羊乳房炎体细胞染色中的运用效果进行具体分析，为日后研究者对乳房炎体细胞染色检测提供了更多合理诊断方法及治疗依据。

姬姆萨染液是由天青与伊红组成。各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不同。嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，被染为紫红色；嗜碱性颗粒如细胞核蛋白或淋巴细胞浆为酸性物质，与碱性染料美蓝或天青结合，被染成深蓝色；中性颗粒呈等电状态，与伊红和美蓝均可结合，呈淡紫色。各类成分由于自身特性与姬姆萨染液中不同物质结合，呈现不同颜色，从而得以区分。

从试验结果可看出，Diff-Quik染色法比姬姆萨染色法和亚甲基蓝染色法更适合用于羊乳房炎乳汁体细胞的检测，其染色后可以在柔和的背景下清晰地观察到不同种类细胞的着色情况，也可以清晰看到被染色后细胞的形态结构。此外，Diff-Quik染色可在短时间内完成，染色后涂片上的乳汁膜不易脱落，不易受到外界干扰。姬姆萨染色法对体细胞染色后，可清晰观察到细胞整体的形态结构，鉴别出多种不同种类的细胞，但本方法染色用时较长，染色后涂片上的乳汁膜易随染色液脱落，增加了涂片制作的难度。亚甲基蓝染色法对体细胞染色后，可清晰看到深蓝色的细胞核与半透明的细胞质，细胞的形态结构明显易于观察，染色后涂片上的乳汁膜不易随染色液脱落，但其染色所需时间长，着色单一，无法对粒细胞的嗜酸碱性进行判断，只能通过对其形态结构的观察大体鉴别出粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。

随着动物福利的发展和动物医学的进步，对奶山羊乳房炎的预防和治疗方法也越来越多样化，及早发现疾病并进行预防诊治至关重要。通过检测奶山羊乳汁对奶山羊的健康状况进行分析，从而制定合理的治疗方案，做到检测与防治相结合，才能更好地控制该病，消除食品安全隐患，提高羊场经济效益。通过本次对3种染色法的研究对比，羊乳房炎乳汁中体细胞检测采用Diff-Quik染色法染色更清晰便捷，乳汁中体细胞的种类和形态结构都更为明显，可快速进行观察鉴别。姬姆萨染色法最大的优势在于染色过程易控，不易被污染［12］，对细胞核的染色效果好，染色时间持久。建议在临床制作奶山羊乳房炎乳涂片时，首选Diff-Quik染色法，其次为姬姆萨染色法。

4 结论

通过对比3种染色法，表明奶山羊隐性乳房炎乳汁中体细胞检测采用Diff-Quik染色法染色更清晰便捷，乳汁中体细胞的种类和形态结构的研究结果都更为明显，可快速的进行观察鉴别。姬姆萨染色法最大的优势在于染色过程易控，染色保持时间久。建议在临床检验奶山羊乳房炎乳涂片时，首选Diff-Quik染色法，其次为姬姆萨染色法。通过对乳汁中体细胞的分类观察与各细胞的不同作用功能相结合，可以了解到羊乳房炎的发展程度，为羊乳房炎的诊断和治疗提供依据。

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Comparison on Three Staining Methods for Detection of Somatic Cell in the Milk of Dairy Goats with Positive Mastitis

Chen Xiaoli，Lin Weiming
（College ofLife Sciences ofLongyan University，Fujian Provincial KeyLaboratoryfor the Prevention and Control ofAnimal Infectious Diseases and Biotechnology，Longyan 364000，China）

This experiment aimed tocompare the advantages and disadvantages of three kinds of staining methods in the detection of somatic cell in the milk of dairy goats with subclinical mastitis.20 milk samples with subclinical mastitis determined by California mastitis detection（CMT）were selected and stained with three methods（Diff-Quik，methylene blue and Giemsa staining method）respectively，and then observed with light microscopy.The results showed that the methylene blue staining method was simple and had good staining effect on the cytoplasm and nucleus，but a long staining time and not conducive to the granulocytes classification because ofa single color；Giemsa stainingmethod was simple and easytocontrol，good stainingeffect on the nucleus，easy to distinguish various types of cells，but a long staining time；Diff-Quik staining procedure was simple，time-short，easy to color the somatic cell and distinguish the nucleus and cytoplasm，neutrophils.Therefore，the Diff-Quik staining method was better than the other twomethods and more suitable for the clinical detection ofsubclinical mastitis ofdairygoats.

subclinical mastitis；somatic cell；Diff-Quik staining；methylene blue staining；Giemsa staining

S858.27

A

2095-3887（2016）05-0051-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.05.014

2016-07-01

龙岩学院博士基金项目（LB2013010）

陈晓丽（1992-），大学本科。

林炜明，副教授，博士。研究方向：动物医学。