低氧预适应对氧糖剥夺损伤SH-SY5Y细胞的保护作用*

卢 娜， 白瑞樱， 黄 河， 李成长， 李超

(1. 新乡医学院生理学与神经生物学教研室， 2. 河南新乡中心医院呼吸内科， 河南 新乡 453003)



低氧预适应对氧糖剥夺损伤SH-SY5Y细胞的保护作用*

(1. 新乡医学院生理学与神经生物学教研室， 2. 河南新乡中心医院呼吸内科， 河南 新乡 453003)

目的：观察低氧预适应(HPC)对氧糖剥夺(OGD)损伤人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的保护作用，并探讨其可能机制。方法：SH-SY5Y细胞随机分为4组：正常对照组：常规培养，不进行OGD处理；HPC处理组: 将神经元放入低氧培养箱内(2% O2)，30 min后立即取出，再恢复常氧培养，反复5次；OGD组：无糖培养基、低氧培养箱内(1% O2)处理细胞10 h，然后复氧复糖培养24 h；HPC + OGD处理组：细胞HPC后，行OGD处理。通过形态学观察，MTT比色法检测细胞存活率，乳酸脱氢酶(LDH) 漏出量判断细胞损伤的程度，原位末端标记(TUNEL)法检测凋亡水平，Western blot检测Caspase 3、低氧诱导因子1α(HIF-1α)的蛋白表达。结果：HPC可减轻 OGD 引起的SH-SY5Y细胞凋亡，降低LDH 漏出量，明显增加 OGD 组SH-SY5Y细胞的活力(P<0.05)。Western blot 显示HPC+OGD 组Caspase 3蛋白的表达明显低于OGD 组(P<0.05)；HIF-1α蛋白的表达明显高于 OGD 组(P<0.05)。结论：HPC对体外培养的SH-SY5Y细胞OGD 损伤具有保护作用，其机制可能与上调HIF-1α蛋白有关。

低氧预适应；人神经母细胞瘤细胞；氧糖剥夺；HIF-1α

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.008

低氧预适应 (hypoxic preconditioning，HPC) 即预先短时间非致死性重复性暴露于低氧，可使机体的组织细胞获得在特殊时间窗对随后更严重甚至致死性缺氧损伤的高度耐受性，是机体一种内源性保护机制，有可能为缺氧的防治提供一种有别于传统吸氧疗法的新策略。已有动物实验从生化、生理等多个侧面证明HPC通过增加脑内糖原、减少能量消耗及抗凋亡、激活自噬等途径减轻缺氧缺血性脑损伤[1-3]。目前，脑低氧预适应的机制尚不十分清楚，许多研究表明其与低氧诱导因子-1α( hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α) 有密切关系[4,5]。HIF-1 普遍存在于人和哺乳动物细胞内，是目前发现的一种能感受细胞氧分压的调控蛋白。21% O2的常氧下，HIF-1表达后即被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解；只有在低氧条件下α和β亚基形成有活性的HIF-1，转移到细胞核内调节多种基因的转录[6]。目前已发现的HIF-1直接作用的靶基因有100多个，涉及多种功能[7]。实验表明HIF-1 调节了神经细胞的损伤过程[8]。但低氧预适应是否可以减轻氧糖剥夺对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的损伤，HIF-1α扮演什么角色，检索国内外文献罕见相关报道。

本实验采用SH-SY5Y细胞,应用体外氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)建立神经细胞缺氧缺血损伤模型, 模拟体内脑缺血过程, 对进一步探讨HPC对缺血缺氧过程中神经元的保护机制, 为探索脑缺血缺氧新的治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及主要仪器

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株由上海中科院典型细胞培养库提供；DMEM培养液、胎牛血清购于美国Hyclone公司；乳酸盐脱氢酶( lactate dehydrogenase，LDH) 检测试剂盒和MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；兔抗HIF-1α多克隆抗体均购自美国ImmunoWay公司；兔抗Caspase 3(激活型)单克隆抗体购自Abgent公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购自Laboratories公司。Thermo Scientific 三气培养箱、OLYMPUS IX71荧光显微镜。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y细胞培养及分组 细胞置于含体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco' s modified eagle medium，DMEM)中，在37℃、含体积分数为5% CO2的饱和水汽培养箱中培养，每隔48 h换培养液，当单层细胞融合后，行传代处理。传代后随机分为4组：对照组(Control)常规培养，不进行OGD处理；低氧预适应模型组(HPC)；氧糖剥夺组(OGD)和低氧预适应后氧糖剥夺组(HPC+OGD)，细胞HPC处理后进行OGD处理。每次每组设6 个平行复孔，实验重复3次。

1.2.2 SH-SY5Y细胞低氧预适应的方法 将SH-SY5Y细胞移至37℃恒温密闭低氧培养箱内(2%O2，5%CO2)，30 min后立即取出，再恢复常氧培养，重复5次，建立细胞低氧预适应模型。

1.2.3 SH-SY5Y细胞OGD模型的建立 选用生长良好的SH-SY5Y细胞，置换成无糖培养基孵育，放入37℃低氧培养箱中培养10 h(1% O2，5% CO2)，然后复氧复糖培养24 h。

1.2.4 形态学观察 SH-SY5Y细胞分别进行不同处理后，置于Olympus CKX41倒置相差显微镜上观察各组细胞形态特征，随机选择视野拍照。

1.2.5 MTT比色法检测细胞存活率 将细胞以5×104cells/ml密度接种于96孔培养板，100 μl/well，24 h后处理细胞。作用完毕后加入MTT(5.0 g/L)10 μl/well、置入培养箱孵育4 h后，每孔再加入100 μl Formanzan溶解液，在细胞培养箱内再继续孵育4 h。采用酶联免疫检测仪在570 nm测定各孔光密度值(optical density，OD)，评价细胞存活率。SH-SY5Y存活率=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。本实验对照组的细胞存活率定为100.00%。

1.2.6 乳酸脱氢酶漏出率检测 根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养孔板中，细胞密度约70%～80%。处理完毕后，将细胞培养板用多孔板离心机400 r/min离心5 min。尽量吸除上清，加入150 μl用PBS稀释了10倍的试剂盒提供的LDH释放试剂(10体积PBS中加入1体积LDH释放试剂)，适当摇晃培养板混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育1 h。随后将细胞培养板用多孔板离心机400 r/min离心5 min，取上清100 μl，加入新的96孔板相应孔中，各孔再加入50 μl LDH检测工作液。混匀，室温(约25℃) 避光孵育30 min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490 nm处测定吸光度。选用600 nm作为参考波长进行双波长测定。LDH (U/L) =(ΔA样品-ΔA空白)×F。F=反应总体积×1 000/样品体积×消光系数[9]。

1.2.7 SH-SY5Y细胞凋亡的检测 取生长状态良好的对数生长期细胞，以2×105cells/ml的细胞密度、每孔细胞悬液500 μl接种于24孔板内的载玻片上。培养24 h后，分组处理细胞；弃培养液、PBS洗涤1次、4%多聚甲醛固定1 h、0.1% Triton X-100冰浴孵育5 min、在样品上加50 μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min，封片后立即在荧光显微镜下观察。在100倍镜下，随机取5个视野，计数呈现绿色荧光的凋亡细胞，取平均值，计算细胞凋亡率=凋亡细胞数/视野下细胞总数。重复3次。

1.2.8 Caspase 3、HIF-1α的蛋白水平的检测 收获细胞，4℃PBS清洗1次，加入60 μl细胞裂解液，用细胞刮刮下细胞，低温离心机12 000 ×g 、4℃离心10 min，取上清，弃沉淀。用BCA法测定各组蛋白含量、配平，每孔上样25 μl，经15%SDS-PAGE 70V电泳2 h后，300 mA恒流转膜40 min，5% 脱脂牛奶常温下封闭1 h后，在 4℃ 孵育 I 抗过夜(兔抗大鼠HIF-1α滴度为1∶1 000、兔抗大鼠Caspase 3(激活型)抗体滴度为1∶1 000、小鼠抗大鼠β-actin滴度均为1∶3 000)；5%脱脂牛奶常温下封闭 II 抗(羊抗兔辣根过氧化物酶IgG和羊抗小鼠辣根过氧化物酶IgG滴度均为1∶5 000，5% 脱脂牛奶配制)，ECL 显影显示目的条带和内参。用Image J软件分析光密度值，分析蛋白表达的相对水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 不同处理组SH-SY5Y细胞形态学观察

倒置相差光学显微镜下观察SH-SY5Y细胞形态的变化，正常SH-SY5Y 细胞大部分呈梭形、三角形，少数呈多边形，胞浆饱满、内有大量颗粒，多数可见细胞突起，折光性好，伸展性良，贴壁能力强；OGD处理后，细胞贴壁数量明显减少，细胞形态不规则，体积明显皱缩[10]，突起减少或消失，折光性减弱，伸展性差，脱壁的细胞增加；HPC+OGD组细胞的缺氧缺糖损伤明显减轻。提示HPC对OGD引起的细胞损伤有保护作用(图1)。

Fig. 1 Effect of HPC and OGD on the morphology of SH-SY5Y cells(×100)

A: Control; B: HPC; C: OGD; D: HPC+OGD; HPC: Hypoxic preconditioning; OGD: Oxygen-glucose deprivation

2.2 不同处理因素对SH-SY5Y细胞存活率的影响

MTT法检测结果以对照组细胞存活率为100.0%，则HPC、OGD、HPC+OGD组存活率分别为97.3%、63.9%、77.6%。OGD、HPC+OGD组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；OGD组与HPC+OGD组比较有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.3 不同处理因素对 SH-SY5Y细胞培养上清液中LDH 漏出量的影响

LDH释放是细胞膜完整性的重要指标，因此LDH漏出量与细胞损伤程度成正比，广泛用于实验研究。LDH活性检测结果显示OGD组、HPC+OGD组培养上清液中LDH漏出量明显高于正常对照组(P<0.05)；HPC+OGD组LDH漏出量明显低于OGD组(P<0.05，表1)。

GroupSurvivalrate(%)LDH(U/L) Control100．0±0．069．5±6．6HPC97．3±2．570．5±6．4OGD63．9±2．1∗207．7±6．3∗HPC+OGD77．6±1．9∗#185．9±6．0∗#

HPC: Hypoxic preconditioning; OGD: Oxygen-glucose deprivation; LDH: Lactatede hydrogenase

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsOGD group

2.4 TUNEL法荧光染色检测细胞凋亡率

TUNEL荧光染色结果显示，与正常对照组相比，OGD组、HPC+OGD组凋亡率明显增加(P<0.05), HPC+OGD组明显低于OGD组(P<0.05，图2，表2)。

Fig. 2 TUNEL staining in each group of SH-SY5Y cells(×200)

A： Control； B： HPC； C： OGD； D： HPC+OGD; HPC: Hypoxic preconditioning; OGD: Oxygen-glucose deprivation

GroupApoptoticrate(%) Control4．3±0．8HPC4．9±0．9OGD29．2±2．1∗HPC+OGD17．6±1．9∗#

HPC: Hypoxic preconditioning; OGD: Oxygen-glucose deprivation

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsOGD group

2.5 Caspase 3、HIF-1α蛋白表达的变化

蛋白质印迹分析结果显示，与正常对照组比较，HPC+OGD组、OGD组cleaved Caspase 3蛋白表达量均增加(P<0.05)；且HPC+OGD组明显低于OGD组(P<0.05)。HPC+OGD组HIF-1α蛋白表达明显高于OGD组(P<0.05，图3，表3)。

Fig. 3 Protein expression of cleaved-Caspase-3、HIF-1α in SH-SY5Y cells

HIF-1α： Hypoxia inducible factor-1α

GroupCleaved⁃Caspase3/β⁃actinHIF⁃1α/β⁃actinControl1．2±0．30．23±0．02HPC0．9±0．21．90±0．08OGD1．7±0．1∗0．36±0．01∗HPC+OGD2．6±0．3∗#0．64±0．02∗#

HIF-1α： Hypoxia inducible factor-1α; HPC: Hypoxic preconditioning; OGD: Oxygen-glucose deprivation

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD group

3 讨论

由于供氧不足或用氧障碍造成组织和细胞的代谢、功能、甚至形态结构发生异常变化的病理过程称之缺氧，其在临床各种疾病中极常见，脑缺血缺氧是导致机体死亡的重要原因[11]。人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)来自于神经发育过程中的神经嵴，表现出与神经元相似的生化、药理和功能方面的特性。它提供了一个可以用来研究神经元功能、分化及死亡的良好体外模型[12]。

HPC指适度的低氧可触发机体的内源性保护机制，使机体对后继发生的严重缺氧或其他致死性应激产生防御和抵抗作用；涉及腺苷、细胞自噬、 HIF-1α、 VEGF等的变化[13]。HIF-1可激活多种靶基因的表达，如胰岛素样生长因子Ⅱ编码基因、血管内皮生长因子(VEGF)编码基因、内皮素-1(ET-1)、血小板源性生长因子(PDGF)等。这些基因表达后参与细胞坏死、凋亡、自噬、能量代谢等生物学效应，以维持组织、细胞在缺氧条件下内环境稳定，以适应缺氧，从而发挥对神经系统的保护作用[14]。肖正霞[15]等研究发现HPC可促进RIRI大鼠视网膜HIF-1α、HO-1蛋白的表达，减轻视网膜损伤，具有视网膜保护作用。徐夏莲[16]等发现HPC上调HIF-1α表达显著改善缺血/再灌注对肾脏的损伤。那么在OGD损伤离体培养的神经元中是否有相似的保护作用呢?本实验以SH-SY5Y细胞为对象，通过HPC干预OGD损伤的细胞模型，观察HPC的保护作用及可能机制。

本研究结果提示HPC明显增加OGD导致的SH-SY5Y细胞存活率、降低LDH漏出量、明显降低OGD导致的SH-SY5Y细胞凋亡率，具有保护作用，与前人实验结果得到HPC对脑缺氧缺血具有保护作用基本相符[17，18]。我们进一步通过Western blot对凋亡相关蛋白Caspase 3及，HIF-1α的表达进行检测, 发现HPC+OGD组、OGD组的激活型Caspase3蛋白量均增加；且HPC+OGD组明显低于OGD组，提示HPC可减轻OGD诱导的细胞凋亡。Western blot结果显示对照组HIF-1α微量表达，而HPC组、OGD组、HPC+OGD组HIF-1α 表达均增强；HPC+OGD组显著高于OGD组；HPC组表达最强。提示OGD本身可以促进HIF-1α 蛋白的表达，而HPC明显上调HIF-1α蛋白的表达。在神经细胞损伤过程中，对HIF-1α的作用颇有争议，现认为HIF-1α可能具有双向适应性调节功能：HIF-1α 轻度或中度诱导表达可促进细胞适应损伤，而过量表达则导致细胞死亡[19，20]。氧是机体能量代谢和稳态平衡的关键物质，低氧微环境下机体呈现强烈的应激及应急反应，并通过氧感受器和信号转导通路特异地在mRNA、蛋白、核定位、转录激活及二聚化等不同层次来提高耐低氧能力[13]。通过离体细胞实验，我们推测HPC促进SH-SY5Y细胞中HIF-1α蛋白的表达，可以减轻OGD对细胞的损伤，延缓细胞凋亡过程的发生，明显增强细胞耐受性，对细胞的存活起一定的保护作用。

综上所述，可以认为HIF-1可是低氧效应的主要执行者，可能在细胞、组织和器官的低氧损伤和适应过程中有关键的调控作用。研究低氧预适应如何启动和调控HIF-1α的激活、HIF-1α蛋白与其它相关蛋白间的相互作用、以及低氧信号转录的精确过程或许能够为应对神经元损伤提供新策略，为脑缺血的防治开辟新的途径，既有理论意义，又有潜在的临床应用前景。

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Protective effect of hypoxic preconditioning on SH-SY5Y cells injured by oxygen-glucose deprivation

LU Na1△， BAI Rui-ying1， HUANG He2， LI Cheng-zhang1， LI Chao-kun1

(1. Department of Physiology and Neurobiology， Xinxiang Medical University，2. Henan Xinxiang Central Hospital Respiratory Medicine， Xinxiang 453003， China)

Objective: To investigate the protection effects of hypoxic preconditioning(HPC) on the SH-SY5Y cell injured by oxygen-glucose deprivation(OGD)，and to discuss the possible mechanism. Methods: SH-SY5Y cells were randomly divided into 4 groups． In normal group，the cells were cultured without OGD treatment． In HPC group，the cultured SH-SY5Y cells were treated for 5 days by intermittently exposing to hypoxic gas mixture (2% O2，5% CO2)for 30 min in every day． In OGD group，the culture medium was replaced by glucose-free medium and the cells were transferred to a humidified incubation chamber flushed by a gas mixture of 1% O2and 5% CO2for 10 h. After that，the cells were fed with glucose-supplemented medium and cultured under normoxic condition for 24 h. In HPC + OGD group，the cultured SH-SY5Y cells were treated for 5 days by intermittently exposing to hypoxic gas mixture for 30 min in each day, then the cells were given the same treatments as those in OGD group. The cell viability was assessed by MTT assay． The degree of the cell damage was evaluated by determining lactate dehydrogenase ( LDH) leakage． TUNEL staining were used to detect the variation of cell apoptosis. The expression of Caspase 3 and hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α) at protein levels was examined by Western blot． Results: Hypoxic preconditioning relieved the cells apoptosis，decreased the amount of LDH leakage and improved the viability of SH-SY5Y cells injured by OGD (P<0.05)． Western blot showed that the expression of Caspase 3 protein in HPC +OGD group was significantly lower than that in OGD group (P<0.05); HIF-1α protein expression was significantly higher than that of OGD group (P<0.05). Conclusion: Hypoxic preconditioning has protective effect oninvitrocultured SH-SY5Y cells injured by OGD. The mechanism may be related to the increase of HIF-1a protein.

hypoxic preconditioning; SH-SY5Y cells; oxygen-glucose deprivation; HIF-1α

河南省教育厅科学技术重点研究项目(14A310009)

2015-10-25

2016-03-01

R363.21

A

1000-6834(2016)04-319-05

△【通讯作者】Tel: 13462225817； E-mail: 13462225817@163.com