丹参酮ⅡA抑制血管平滑肌细胞增殖的机制

陆敬平，王沛

丹参酮ⅡA抑制血管平滑肌细胞增殖的机制

陆敬平1，王沛1

目的 探讨丹参酮ⅡA抑制血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的机制。方法 组织贴块法培养SD大鼠腹主动脉VSMC，随后分为对照组：VSMC加入50 μl 30% FBS培养液，A组：10 mg/L丹参酮ⅡA 25μl +30% FBS培养液25 μl，B组：20 mg/L丹参酮Ⅱ A 25μl +30% FBS培养液25 μl，每组设置4个复孔。采用四唑盐（MTT）法检测VSMC的细胞毒性，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，RT-PCR检测p21 mRNA相对表达量。结果 MTT检测结果，对照组吸光度值明显高于药物干预A组和B组，差异有统计学意义（P均＜0.05）；B组吸光度值明显低于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）。丹参酮Ⅱ A干预的A组和B组细胞凋亡率明显高于对照组，而B组凋亡率明显高于A组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与对照组比较，A组和B组p21 mRNA的相对表达量明显升高，同时，B组p21 mRNA相对表达量明显高于A组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论 丹参酮Ⅱ A对VSMC的增殖有明显的抑制作用，其机制可能与细胞周期蛋白p21表达增强有关。

丹参酮ⅡA；血管平滑肌细胞；增殖；细胞周期蛋白p21

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、高血压、糖尿病血管并发症等均为老年人群多发的心血管疾病，血管平滑肌细胞（VSMC）的异常增殖和迁移是其共同病理基础，目前认为抑制VSMC增殖是抑制心血管疾病发展的基础[1,2]。丹参是心血管疾病治疗常用中药，具有广泛的药理作用[3]。丹参酮ⅡA是一种从丹参中提取出来的脂溶性有效成分，能够保护血管内皮细胞、抑制血小板聚集、改善心肌缺血区冠状动脉血流量[4]。目前有研究显示[5]，丹参酮ⅡA能够抑制VSMC增殖。本研究采用组织贴块法培养SD大鼠主动脉VSMC，并分别采用不同浓度丹参酮ⅡA进行干预，分析各组细胞情况，探讨丹参酮ⅡA抑制VSMC增殖的潜在机制。

1　材料与方法

1.1试剂及材料 胎牛血清（江苏绿叶生物科技有限公司）、丹参酮ⅡA（中国药品生物鉴定所）、低糖DMEM培养液（上海卡迈舒Kmaels科技实业有限公司）、RT-PCR试剂盒（Promega公司）、Binding Buffer与V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（上海卡迈舒Kmaels科技实业有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1大鼠VSMC培养 选取100～150 g健康雄性SD大鼠，由西安交通大学提供，脱臼处死后，无菌条件下取大鼠腹主动脉，并将外周结缔组织、内膜去除；将中膜层组织用预冷的PBS冲洗后剪成小块，接种于培养瓶。细胞置于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM低糖培养液中，于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，经过一周生长，细胞从组织边缘爬出，此后每隔一天换一次培养液，待细胞长至70%～80%融合状态后即可传代。然后取4～6代VSMC 进行纯化，分组干预。

1.2.2细胞分组和染色 对照组：VSMC加入50 μl 30% FBS培养液，A组：10 mg/L丹参酮Ⅱ A 25μl +30% FBS培养液25 μl，B组：20 mg/L丹参酮ⅡA 25μl +30% FBS培养液25 μl。使用试剂盒，免疫组化法对细胞平滑肌α-肌动蛋白进行染色。

1.2.3四唑盐（MTT）法检测细胞毒性 收集对数期细胞，将细胞消化，离心制成细胞悬液，在倒置显微镜下测定细胞浓度，接种于96孔板，加入10% FBS的DMEM培养液，置37℃、 5%CO2孵箱培养24 h，细胞贴壁后，按1.2.2分组给药，每组设4个复孔，在振动器上混匀，置于培养箱中培养24 h，取出，每孔加入20μl MTT（5 g/L），继续培养4 h，吸取上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜（DMSO），振荡充分融解结晶物。在酶标仪上测定各孔吸光度，波长570 nm，吸光度值越高提示促进细胞增殖，越低提示抑制增殖。

1.2.4流式细胞仪检测凋亡 将6代VSMC细胞接种于32孔培养板，2×105个/孔，置37℃、5%CO2孵箱培养24 h，按1.2.2分组给药，每组设4个复孔，在振动器上混匀，孵育6 h，弃去培养基，PBS洗涤2次，用0.25%胰蛋白酶消化分散为单细胞，将细胞悬液用PBS洗涤2次，2000 rpm离心10 min，弃去上清，加100 μl Binding Buffer与10 μl FITC标记的Annexin V（20 μg/ml），避光30 min，加5 μl碘化丙啶（50 μg/ml），避光5 min，加400 μl Binding Buffer，立即进行流式细胞术定量检测，同时以不加Annexin V的一管为阴性对照，利用CEI I Quest软件检测分析并计算凋亡细胞占总细胞的百分数，即细胞凋亡百分率。

1.2.5RT-PCR检测 给药干预48 h后，按照Ttizol Reagent的说明书步骤进行总RNA提取，采用PCR仪进行逆转录，逆转录合成第一条cDNA：45℃，45 min；鸟类成髓细胞白细胞病毒反转录酶激活：94℃，2 min；合成第2条cDNA链并进行PCR扩增，变性：94℃，30 s；退火：58℃，1 min；延伸：72℃，1 min；最终延伸：72℃，7 min，进行1个循环。p21引物上游序列：5’-C GAGAACGGTGGAACTTTGAC-3’，下游序列：5’-CAGGGCTCAGGTAGACCTTG-3’，扩增片段长度106 bp。内参β-actin引物上游序列：5’-AACAATAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’，下游序列：5’-TACTGAGGTAGTCTGTCAG-3’，扩增片段长度241 bp。制备2.0%琼脂糖凝胶，加入PCR扩增产物，电泳电压100V，约30～40 min，将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相分析。

1.3统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较使用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1VSMC鉴定结果 经特异的平滑肌α-肌动蛋白免疫细胞化学染色后，高倍镜下可见胞质内出现大量棕色，并且与长轴平行的纤维细丝，即平滑肌α-肌动蛋白丝（图1）。

2.2各组平滑肌细胞抑制比较 对照组吸光度值明显高于药物干预A组和B组，差异有统计学意义（P均＜0.05）；B组吸光度值明显低于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.3各组细胞凋亡情况比较 丹参酮Ⅱ A干预的A组和B组细胞凋亡率明显高于对照组，而B组凋亡率明显高于A组，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表2）。

2.4各组p21 mRNA相对表达量比较 与对照组比较，A组和B组p21 mRNA的相对表达量明显升高，同时，B组p21 mRNA相对表达量明显高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3，图2）。

3　讨论

图1　平滑肌α-肌动蛋白免疫细胞化学染色（×400）

表1　各组吸光度值比较（n=4）

表2　各组凋亡率比较（n=4）

表3　各组p21 RNA相对表达量比较（n=4）

图2　各组p21凝胶电泳图（1：对照组；2：A组；3：B组）

丹参，性味苦、微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、清心除烦、活血通经之功效，是常用活血化瘀中药[6]，临床常用于治疗冠心病和心绞痛等心脑血管疾病。大量动物实验表明，丹参具有多种药理作用，如增加血流量、扩张冠状动脉、减慢心率、增强心肌收缩力、改善心脏功能和促进组织修复等[7]。丹参酮ⅡA是丹参的主要有效成分，可抑制各种因素引起的平滑肌细胞增殖，在微循环和抗缺血缺氧方面具有积极作用[8]。

VSMC在正常生理条件下，发挥调节血管张力，分泌释放调节因子和维持血管正常功能的作用[9]。当机体血管内皮功能受到损伤，多种细胞因子释放并作用于VSMC膜受体，能够激活细胞内多条信号传导通路，促进VSMC增殖[10,11]。VSMC自中膜迁移至内膜下间隙并异常增殖是多种心血管疾病的共同病理基础，抑制VSMC增殖是目前治疗心血管疾病的靶点[12]。本研究分离大鼠腹主动脉通过培养获得VSMC，采用不同浓度的丹参酮ⅡA进行干预，通过MTT法检测细胞毒性，结果显示，与对照组相比，丹参酮ⅡA干预的A组和B组吸光度值明显降低，提示丹参酮ⅡA具有抑制VSMC增殖的作用，与李泽争等[13]和沈晓君等[14]研究结果基本一致。

VSMC的增殖和迁移受多种细胞、生长因子以及活性代谢产物的影响和调节，本质上是受相关基因调控[15]。各种细胞增殖周期相对固定，改变细胞周期只能对G1期进行调控。G1/S检验点是细胞在G1期进入S期之前必须要通过的，如果细胞受到抑制，则不能通过该点，细胞周期停顿，增殖受到抑制。p21基因定位于人染色体6p21.2，DNA长度为85kb[16]，p21基因表达的产物p21蛋白定位于细胞核中，由164个氨基酸组成，是细胞周期负性调控蛋白。在某些条件的诱导下，p21基因可促进细胞凋亡[17]。本研究通过检测3组p21 RNA表达和细胞凋亡显示，对照组p21 mRNA相对表达量和细胞凋亡率明显低于药物干预的A组和B组，提示丹参酮ⅡA可能通过抑制VSMC的p21 mRNA表达抑制其增殖。该结果与李靖等[18]研究结果相似。

综上所述，丹参酮II A对FBS诱导的VSMC增殖有明显的抑制作用，其机制可能与细胞周期蛋白p21表达增强有关。但本研究仅设置了2个药物浓度，有必要增加浓度找出细胞抑制率约50%的浓度，以排除药物浓度过高对细胞的毒性作用。

[1] Moraes J A,Frony AC,Dias AM,et al. Data in support of alpha1beta1 and integrin-linked kinase interact and modulate angiotensin II effects in vascular smooth muscle cells[J]. Atherosclerosis,2015,243 (2)：477-85.

[2] 马丙祥,董宠凯. 丹参的药理作用研究新进展[J]. 中国药房,2014,25(7)：663-5.

[3] 闫薇薇,徐国良,秦玲. 丹参酮ⅡA磺酸钠注射液治疗冠心病心绞痛有效性及安全性的Meta分析[J]. 中国中医急症,2014,23(3)：413-5.

[4] Wu G,Cai J,Han Y,et al. LincRNA-p21 regulates neointima formation, vascular smooth muscle cell proliferation, apoptosis, and atherosclerosis by enhancing p53 activity[J]. Circulation, 2014,130(17)：1452-65.

[5] 李泽争,王葳,王巍巍,等. 丹参酮ⅡA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及机制探讨[J]. 中国中西医结合肾病杂志,2015,16(10)：861-5.

[6] 庄钦,毛威. 丹参多种活性成分调节血管新生机制的研究概述[J].浙江中医药大学学报,2014,38(4)：506-10.

[7] 余良主,石春蓉. 丹参酮ⅡA对高血压大鼠左心室肌肾素-血管紧张素系统不同成分表达量的影响[J]. 中国中药杂志,2014,39(8)：1468-72.

[8] Huang X,Li Y,Jing L,et al. Tanshinone IIA dampens the cell proliferation induced by ischemic insult in rat astrocytes via blocking the activation of HIF-1α/SDF-1 signaling[J]. Life Sciences, 2014,112(1-2)：59-67.

[9] Rahabi-Layachi H,Ourouda R,Boullier A,et al. Distinct Effects of Inorganic Phosphate on Cell Cycle and Apoptosis in Human Vascular Smooth Muscle Cells[J]. J Cell Physiol,2015, 230(2)：347-55.

[10] 陈芬燕,郭韧,张毕奎. 丹参酮ⅡA的心血管药理作用研究进展[J].中国中药杂志,2015,40(9)：1649-53.

[11] 张蓓蓓,蔡辉. 丹参酮ⅡA对心室重构作用的研究进展[J]. 安徽医药,2014,18(12)：2230-3.

[12] Li J,Zhao L,He X,et al. MiR-21 inhibits c-Ski signaling to promote the proliferation of rat vascular smooth muscle cells[J]. Cell Signal,2014,26(4)：724-9.

[13] 李泽争,王葳,王巍巍,等. 丹参酮ⅡA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及机制探讨[J]. 中国中西医结合肾病杂志,2015,16(10)：861-5.

[14] 沈晓君,高爱社,关怀敏,等. 丹参酮ⅡA对兔动脉粥样硬化病灶凋亡相关基因表达的影响[J]. 中国老年学杂志,2013,33(01)：90-2.

[15] 龙向淑,吴强,宋方,等. 干扰素α通过P204和P21诱导大鼠原代血管平滑肌细胞凋亡[J]. 基础医学与临床,2014,34(12)：1635-9.

[16] 李涛,冯爱桥. 姜黄素对氧化型低密度脂蛋白诱导的大鼠血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1表达、细胞增殖和凋亡的影响[J]. 中国医药导报,2014,11(21)：8-12.

[17] 李蓉,钟益刚,钱康. 人参皂苷Rb1通过上调P53和P21抑制PDGFBB诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖[J]. 实用药物与临床,2014,17(12)：1516-22.

[18] 李靖. 丹参酮Ⅱ-A对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖及p21表达的影响[D].大连医科大学,2009.

本文编辑：姚雪莉

Mechanism of tanshinone ⅡA in inhibiting proliferation of vascular smooth muscle cells

LU Jing-ping*, WANG Pei.
*First Clinical School, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China.

LU Jing-ping, E-mail: addaa163@163.com

Objective To discuss the mechanism of tanshinone ⅡA (Tan ⅡA) in inhibiting the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods The abdominal aortic VSMC were cultured by using tissue explant method, and then VSMC were divided into control group [in nutrient solution of 30% fetal bovine serum (FBS, 50 μl)], group A [in nutrient solution of Tan ⅡA (10 mg/L, 25 μl) and 30% FBS (25 μl)], and group B [in nutrient solution of Tan ⅡA (20 mg/L, 25 μl) and 30% FBS (25 μl)]. The cytotoxicity of VSMC was detected by using methyl thiazolyl tetrazolium test (MTT), apoptosis of VSMC was detected by using flow cytometer, and relative expression of cyclin (p21) mRNA was measured by using reverse transcription-polymerase chain reaction (RTPCR). Results The results of MTT detection showed that the absorbance value was significantly higher in control group than that in group A and group B (all P<0.05), and was significantly lower in group B than that in group A (P<0.05). The apoptosis of VSMC was significantly higher in group A and group B than that in control group, and was significantly higher in group B than that in group A (all P<0.05). Compared with control group, the relative expression of p21 mRNA increased significantly in group A and group B, and was significantly higher in group B than that in group A (all P<0.05). Conclusion Tan ⅡA has significant inhibitory effect on the proliferation of VSMC, and the mechanism maybe related to higher expression of p21.

Tanshinone ⅡA; Vascular smooth muscle cells; Proliferation; Cyclin (p21)

R541.4

A

1674-4055(2016)10-1220-03

1210000 南京,南京中医药大学第一临床医学院

陆敬平,E-mail：addaa163@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.10.20