血浆同型半胱氨酸及5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与老年原发性高血压合并冠心病的关系

赵艳梅，王东旭，许为炎，蔺晶晶，黄翠娟，王正东，梁萍

血浆同型半胱氨酸及5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与老年原发性高血压合并冠心病的关系

赵艳梅1，王东旭1，许为炎1，蔺晶晶2，黄翠娟1，王正东1，梁萍3

目的 探讨血浆同型半胱氨酸（Hcy）水平及其代谢酶5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因多态性与老年原发性高血压合并冠心病的关系。方法 选择2014年2月～2015年2月于玉林市第一人民医院心内科住院的老年原发性高血压患者共200例，其中男性115例，女性85例，平均年龄（67.52±3.53）岁。根据冠状动脉造影结果分为高血压组（100例）及冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）组（100例）。选取同时期的健康体检者100例为对照组。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法检测3组MTHFR C677T 基因型，同时检测Hcy水平。结果 与对照组比较，高血压组和冠心病组血压、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、Hcy均升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。高血压组MTHFR C677位点CC、CT和TT基因型频率分别为27.0%、50.0%和23.0%，C和T等位基因频率分别为52.0%和48.0%。冠心病组CC、CT和TT基因型频率分别为12.0%、55.0%和33.0%，C和T等位基因频率分别为39.5%和60.5%。对照组CC、CT和TT基因型频率分别为40.0%、45.0%和15.0%，C和T等位基因频率分别为62.5%和37.5%。冠心病组TT型基因频率及T等位基因频率均高于高血压组和对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。冠心病组患者TT型Hcy水平高于CC型和CT型，差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论 MTHFR C677T基因多态性中TT基因型可能是老年原发性高血压合并冠心病的一个重要遗传风险因子，T等位基因可能为该病的风险等位基因。

同型半胱氨酸；5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶；基因多态性；老年原发性高血压；冠心病

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病，CHD）是中国人群常见心血管疾病，其重要的危险因素有高血压、糖尿病、高血脂、吸烟等，发病率逐年上升。有研究表明[1]，同型半胱氨酸（Hcy）水平升高可引起动脉粥样硬化，可能参与高血压及冠心病的发病。也有研究表明[2]，高Hcy血症是心脑血管疾病发生的独立危险因素。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是Hcy代谢过程的关键酶，受种族、地域等因素影响，该基因677碱基C/T突变影响其活性，进而影响Hcy代谢，而其多态性与高血压、冠心病的关系在国内外研究中亦不一致。本研究主要讨论了Hcy水平、MTHFR基因 C677T多态性与广西玉林地区汉族老年原发性高血压合并冠心病的关系。

1　资料与方法

1.1研究对象和分组 选择2014年2月～2015年2月

于玉林市第一人民医院心内科住院的老年原发性高血压患者共200例，其中男性115例，女性85例，平均年龄（67.52±3.53）岁。高血压诊断参照中国高血压防治指南（2005年修订）制定的标准[3]，收缩压≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和/或舒张压≥90 mmHg。冠心病诊断标准：经冠状动脉造影证实在左主干、左前降支、回旋支或右冠状动脉中至少有1支血管狭窄程度＞50%。排除标准：继发性高血压、糖尿病、心力衰竭、自身免疫性疾病、严重肝肾功能不全、非汉族及其他恶性疾病患者。所有研究对象均来自广西玉林地区无血缘关系的汉族老年人群。所有入选者自愿参加，并签订知情同意书。本研究经玉林市第一人民医院伦理委员会讨论通过。根据冠状动脉造影结果分为高血压组（100例）及冠心病组（100例）。高血压组中男性63例，女性37例，年龄范围60～75岁，平均年龄（67.49±3.54）岁；冠心病组中男性52例，女性48例，年龄范围60～75岁，平均年龄（67.56±3.25）岁。选取同时期的健康体检者100例为对照组，男性45例，女性55例，年龄范围60～75岁，平均年龄（67.52 ±3.62）岁。

1.2标本收集 患者抽取空腹9～12 h肘静脉血10 ml。一管EDTA抗凝，混匀-80℃保存，用于提取基因组DNA，另一管肝素抗凝，用于生化指标检测。

1.3Hcy水平及各项生化指标检测 采用罗氏

Cobas-8000生化分析仪通过循环酶法来测定Hcy含量，其他生化指标三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测严格按试剂盒说明书进行操作。Hcy正常值设定为＜10μmol/L。

1.4MTHFR C677T 基因分型检测

1.4.1DNA提取 使用亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C/T检测试剂盒（PCR-RFLP）提取 DNA，操作按说明书进行，提取后的DNA保存于-20℃冰箱。试剂盒购自深圳奥萨制药有限公司。

1.4.2PCR扩增及检测 引物设计使用 Primer 3 Input网络软件，由上海生工生物合成，上游引物：5′-ATGACCTGCTGCCGTCAGCG-3′，下游引物：5 ′-CCGCAACTATGGCATCGAGC-3′。反应体系为25 μl，包括模板DNA 3 μl，PCR扩增混合液21.8 μl和Taq DNA聚合酶0.2 μl。应用PCR基因扩增仪进行扩增。94℃预变性3 min，94℃变性30 s，65℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环。循环完毕，72℃再延伸7 min。酶切及电泳：对PCR扩增产物理想的样品进行酶切分析。反应体系为15 μl，包括PCR产物10 μl，HinfⅠ内切酶（深圳奥萨制药有限公司提供）0.3 μl，酶切缓冲液4.7 μl。37℃温育1 h，酶切反应终止后其产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，室温恒压1～5 V/cm电泳10 min，最后在凝胶成像仪下观察并照相，进行基因分型。

1.5统计学处理 采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间均数的比较采用方差分析，计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1三组一般临床资料比较 与对照组比较，高血压组和冠心病组血压、TG、TC、LDL-C、Hcy均升高，同时，冠心病组较高血压组上述指标也明显升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表1）。

2.2MTHFR C677T 基因型鉴定 PCR扩增后再经Hinf Ⅰ内切酶酶切，37℃温育后再经2%琼脂糖凝胶电泳检测，成像仪下得到三种基因型：CC型为一个274 bp的片段，凝胶成像仪下见一个274 bp条带；CT型，成像仪下可见274 bp和228 bp两个条带；TT型，成像仪下可见228 bp条带（图1）。

2.3三组MTHFR基因型和等位基因频率比较 三组MTHFR C677T均表达CC、CT和TT基因型，且其频率的分布均符合Hardy-Weinberg平衡，说明样本具有群体代表性。高血压组CC、CT和TT基因型频率分别为27.0%、50.0%和23.0%，C和T等位基因频率分别为52.0%和48.0%。冠心病组CC、CT和TT基因型频率分别为12.0%、55.0%和33.0%，C和T等位基因频率分别为39.5%和60.5%。对照组CC、CT和TT基因型频率分别为40.0%、45.0%和15.0%，C和T等位基因频率分别为62.5%和37.5%。冠心病组TT型基因频率及T等位基因频率均高于高血压组和对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表2）。

2.4冠心病组各基因型Hcy水平的比较 不同MTHFR基因型血浆Hcy 水平：TT型（23.29± 5.46） μmol/L、CT型（22.67±6.17） μmol/L、CC型（20.17±5.6）μmol/L。

TT型Hcy水平高于CC型和CT型，差异有统计学意义（P均＜0.05）。

表1　三组一般资料比较

图1　基因多态性电泳图

3　讨论

高血压是冠心病、脑卒中发生的重要危险因素，而高Hcy血症是引起动脉粥样硬化及相关并发症的危险因素[2]，伴有Hcy升高的高血压患者其血管疾病风险比正常人高10.3倍[4]。Hcy是一种含硫氨基酸，是蛋氨酸的中间代谢产物，在人体内不能合成，有关Hcy升高引发动脉粥样硬化的机制可能有：①Hcy通过氧化产生自由基引起血管内皮损伤，抑制NO、前列环素的合成并促进其降解，引起高血压[5]；②通过上调血管内皮细胞中Fas分子，使血管内皮素-1增多，进而引起血管内皮细胞功能紊乱[6]；③通过内质网应激增加Caspase-3的活性，诱导祖细胞凋亡致动脉硬化、血管平滑肌增生[7]，同时可促进胶原纤维合成及平滑肌细胞增殖。MTHFR是Hcy再甲基化代谢途径中的关键酶。人类MTHFR基因位于染色体1p36.3，全长17kb，具有多态性。当MTHFR发生错位突变（677C→T）置换，使MTHFR活性降低，引起Hcy代谢受阻进而引起Hcy升高[8]。所以，很多研究者致力于MTHFR基因多态性与高血压合并冠心病关系的研究。

关于MTHFR基因C677T位点多态性与高血压、冠心病的关系国内外研究结果报道不一。Lwin H等[9]在研究日本男性MTHFR基因C677T多态性与高血压的关系时，发现MTHFR基因C677T多态性与高血压无关。Muniz等[10]研究发现，MTHFR C677T多态性与冠心病无关。然而，Golledge J等[11]对土耳其人研究发现MTHFR基因C677T多态性是高血压的独立危险因素。Morita H等[12]研究发现MTHFR基因多态性与冠心病相关。Gupta SK等[13]在研究印第安人时发现高Hcy是冠心病的独立危险因素。本研究结果显示，MTHFR不同基因型Hcy水平有差异，冠心病组患者TT型Hcy水平高于CC型和CT型，这与尹春琳等[14]的研究结果相似。三组中MTHFR基因以CT型最多，冠心病组较对照组和高血压组TT基因型频率及T等位基因频率增加，提示MTHFR基因C677T多态性与高血压患者冠心病的发病有一定的关系，携带T等位基因的广西玉林地区汉族老年人群发生高血压合并冠心病的风险较高，T等位基因可能为该地区发生高血压合并冠心病的易感基因。

IIhan N等[15]对土耳其人MTHFR C677T基因多态性与原发性高血压、冠心病的研究时发现，高Hcy水平与冠心病有关，在冠心病患者中，TT基因型比CC和CT基因型患者的Hcy水平高。由此可推断，在高血压条件下，携带TT基因型的高血压患者可促使Hcy水平增高，加剧了高血压患者发生冠心病的风险，因此，MTHFR 基因多态性可能参与高血压患者冠心病的发病过程。

总之，老年高血压患者合并冠心病比较复杂，可能与基因型、环境因素、种族等有关。本研究发现，Hcy升高及其代谢酶（MTHFR）C677T基因多态性可能与广西玉林地区汉族老年高血压患者发生冠心病有关，TT基因型可能为该人群易感基因型。当然，由于本研究样本例数偏少，结果难免存在一定偏差，有待更大规模的研究揭示该基因与高血压合并冠心病的关系。

表2　三组 C677T基因型和等位基因频率比较（n，%）

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本文编辑：姚雪莉

Relationship between homocysteine or gene polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase and essential hypertension complicating coronary heart disease in elderly patients

ZHAO Yan-mei*, WANG Dong-xu, XU Wei-yan, LIN Jing-jing, HUANG Cui-juan, WANG Zheng-dong, LIANG Ping.
*Department of Cardiology, First People's Hospital of Yulin City, Yulin 537000, China.

WANG Dong-xu, E-mail: zhaoyanmeigood@126.com

Objective To discuss the relationship between homocysteine (Hcy) or gene polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and essential hypertension complicating coronary heart disease (CHD) in elderly patients. Methods The patients with essential hypertension (n=200, male 115, female 85 and average age=67.52±3.53) were chosen from the Department of Cardiology of First People’s Hospital of Yulin City from Feb. 2014 to Feb. 2015. The patients were divided, according to outcomes of coronary angiography (CAG), into hypertension group and CHD group (each n=100). At the same time, healthy controls (n=100) were chosen as control group. The genotypes of MTHFR C677T were detected by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method and Hcy level was detected meanwhile in 3 groups. Results Compared with control group, blood pressure, triglyceride (TG), total cholesterol (TC), low-density lipoproteincholesterol (LDL-C) and Hcy increased in hypertension group and CHD group (all P<0.05). In hypertension group, the frequency was 27.0% in CC genotype, 50.0% in CT genotype and 23.0% in TT genotype, and frequency was 52.0% in C allele and 48.0% in T allele at MTHFR C677 locus. In CHD group, the frequency was 12.0% in CC genotype, 55.0% in CT genotype and 33.0% in TT genotype, and frequency was 39.5% in C allele and 60.5% in T allele. In control group, the frequency was 40.0% in CC genotype, 45.0% in CT genotype and 15.0% in TT genotype, and frequency was 62.5% in C allele and 37.5% in T allele. The frequency of TT genotype and frequency of T allele were higher in CHD group than those in hypertension group and control group (all P<0.05). Hcy level was higher in TT genotype than that in CC genotype and CT genotype in CHD group (all P<0.05). Conclusion TT genotype of MTHFR C677T maybe an important genetic risk factor, and T allele maybe a risk allele for CHD in elderly patients with essential hypertension.

Homocysteine; Methylenetetrahydrofolate reductase; Gene polymorphisms; Senile essential hypertension; Coronary heart disease

R544.1

A

1674-4055(2016)10-1191-04

玉林市科学研究与技术开发计划项目(1421036)民医院体检中心

1537000 玉林,玉林市第一人民医院心内科;2102209

王东旭,E-mail：zhaoyanmeigood@126.com北京,北京王府中西医结合医院急诊科;3537000 玉林,玉林市第一人

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.10.11