外源性骨强化蛋白对强直性脊柱炎小鼠的疗效研究

刘 亚，张晓军

(1.商洛市中心医院药剂科，商洛 726000；2.第四军医大学生物医学工程系物理教研室，西安 710032)



·药理·

外源性骨强化蛋白对强直性脊柱炎小鼠的疗效研究

刘 亚1，张晓军2*

(1.商洛市中心医院药剂科，商洛 726000；2.第四军医大学生物医学工程系物理教研室，西安 710032)

目的 评估外源性骨强化蛋白(sclerostin，SOST)治疗强直性脊柱炎的疗效。方法BALB/cIL-4小鼠每隔2周皮下注射2mg人蛋白多糖，8周后诱导脊柱炎(PGISp)模型，PGISp小鼠体内SOST表达下调。随后将PGISp小鼠根据治疗方案，分为SOST组与阳性对照组。SOST组注射2.5μg重组SOST(recombinantSOST，rSOST)，持续8周。阳性对照组注射同剂量外源性Wnt通路抑制因子Dickkopf1(DKK-1)，同样持续8周。使用双能X线骨密度仪(DEXA) 检测2组小鼠组织学和骨骼变化，评估外周关节及中轴骨疾病的发展状况。结果SOST组外周或轴向疾病发展，骨质密度或疾病严重程度均无改善。rSOST注射8h达到峰值，注射24h后血浆SOST质量浓度水平较高，导致循环系统SOST血清水平累积。免疫组化法检查骨细胞水平，阳性对照组中未受累关节内骨细胞水平显著低于受累关节内骨细胞水平；SOST组小鼠不同关节之间的骨细胞水平无差异。组间未受累关节进行比较，阳性对照组优于SOST组。结论rSOST未能降低关节内的骨细胞水平，但其具有生物活性。今后需要改变剂量，提高骨靶向能力，从而影响骨生成；目前外源性骨强化蛋白疗效不及DKK-1。

强直性脊柱炎；Wnt通路抑制因子Dickkopf1；骨强化蛋白；骨形成

强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis，AS)是一种典型的脊椎关节病[1]。AS患者体内Wnt信号途径促进AS患者骨细胞发育，导致过度骨生成[2]。Wnt抑制因子骨强化蛋白(sclerostin,SOST)可特异性地抑制骨生成，改善患者生活质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器 双能X线骨密度仪(DEXA，上海爱申科技发展股份有限公司)。

1.2 试药 人蛋白多糖(北京达科为生物技术有限公司)；SOST(诺华制药有限公司，瑞士)；苏木精-伊红染色液(舜田生物有限公司)；DKK-1(上海伯易生物科技有限公司)。

1.3 动物 3月龄雌性BALB/cIL-4小鼠，体质量为40±5g(南京君科生物工程有限公司)。本研究遵循动物实验3R原则，获得动物医学伦理委员会批准，所有小鼠均饲养于特定无菌房，可随意饮水且配有标准食物。

2 方法

2.1 疾病诱导及治疗 小鼠每隔2周皮下注射2mg人蛋白多糖，连续8周诱导脊柱炎(PGISp)模型，PGISp小鼠体内SOST表达下调。随后将PGISp小鼠分为SOST组与阳性对照组。SOST组每日皮下注射2.5μg重组SOST(recombinantSOST，rSOST)杜氏磷酸盐缓冲液，连续注射8周。阳性对照组注射同等剂量的DKK-1。

2.2 观察指标 每日记录所有小鼠的外周疾病，并进行评分。用双能X线骨密度仪(DEXA) 检测骨密度。首次注射rSOST之前，采集小鼠血清，扫描骨密度，作为基线值。rSOST注射8周后处死小鼠，用于组织学检查。

2.3 组织学评分 椎间关节经苏木精-伊红(H&E)染色后，采用组织学评分系统进行评分：1分：肌腱端炎，炎性细胞聚集在椎间盘或纤维环渗透；2分：椎间盘破坏<50%；3分：椎间盘破坏>50%；4分：软骨/骨关节强直。

2.4 统计学分析 用GraphPadPrism统计软件进行数据分析。数据用百分比表示，用t检验比较组间差异。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 SOST组血浆质量浓度分析 SOST组首次注射rSOST 24h内,用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测rSOST血浆质量浓度｡rSOST注射后15min及1,2,4,8和24h的血浆质量浓度分别为2.0,3.2,3.5,3.0,3.5和2.5ng·mL-1｡

治疗第4周后，检测循环系统中的SOST血浆质量浓度，SOST组和阳性对照组SOST血浆质量浓度明显下降；第8周，2组SOST的血浆质量浓度略有回升。

3.2 2组外周关节病变比较SOST组小鼠，外周关节炎先于轴向疾病，爪肿胀度和后腿关节僵硬度评分较高。2.5μg剂量的rSOST未改善外周关节病情，见图1。2组之间差异无统计学意义。

图1rSOST对外周关节疾病的影响

Fig.1ImpactofrSOSTtreatmentonperipheraldiseaseprogression

3.3 中轴骨病变组织学分析 组织学检查轴向疾病进展。苏木精-伊红(H&E)染色椎间关节评分显示：2组病变椎间关节和异位关节无差异；2组小鼠的椎间关节和椎间盘均受到破坏；2组小鼠全身、脊椎和股骨骨矿物质密度(BMD)组间存在差异，治疗初期及结束，2组骨密度变化无差异。见图2。

图2rSOST对骨密度的影响

A.全身骨密度(P=0.09)；B.脊柱终端和骨盆骨密度(P=0.01)；C.右股骨骨密度(P=0.02)；D.全身骨密度(P=0.06)；E.2组整体骨密度随时间变化(P=0.01)

Fig.2rSOSTimpactonbonedensity

A.thewholebodybonemineraldensity(P=0.09);B.terminalspineandpelvisbonemineraldensity(P=0.01);C.therightfemurbonemineraldensity(P=0.02);D.thewholebodybonemineraldensity(P=0.06);E.overallbonemineraldensitychangesovertimeinthe2groups(P=0.01)

阳性对照组未受累关节内骨细胞水平显著低于受累关节内骨细胞水平(P<0.05)；SOST组不同关节之间的骨细胞水平无差异。2组未受累关节骨细胞水平比较，SOST组显著高于阳性对照组(P<0.05)。

4 讨论

目前没有任何治疗方案可逆转或显著减缓强直性脊柱炎过度骨生成。多项研究证实，AS患者体内Wnt抑制因子SOST水平下降，导致Wnt信号上调，促进骨生成[3-5]。此外，HaynesKR等[6]报道，通过抑制β-catenin功能，可实现Wnt信号通路抑制[7]。因此，外源性补充SOST可抑制Wnt信号途径，成为潜在的AS治疗靶点。本研究发现，注射rSOST后，SOST组的PGISp小鼠，周围关节或中轴骨骼关节病变并未改善，说明外源性SOST并未发挥抑骨作用。其无效原因可能为SOST被血液中的其他蛋白附着，从而阻止SOST的活性。

rSOST治疗无效因素包括rSOST自身药效、rSOST稳定性、rSOST靶向性和注射剂量。研究表明，人体SOST在小鼠模型有效(人SOST转基因小鼠)，可减少骨质增生[8]。SOST高表达可有效阻止Wnt信号途径，最终导致骨细胞活动和骨生成显著降低。本研究SOST组注射rSOST后，ELISA法24h内检测rSOST血浆质量浓度。rSOST注射后15min及1，2，4，8和24h的血浆质量浓度分别为2.0，3.2,3.5,3.0,3.5和2.5ng·mL-1。循环系统中rSOST保持较高的血浆质量浓度，说明rSOST在小鼠体内降解缓慢。外源性SOST导致循环系统SOST总体水平提高，但是外周关节炎先于轴向疾病，爪肿胀度和后腿关节僵硬度评分较高，外周关节病情未改善，2组小鼠全身、脊椎和股骨骨矿物质密度(BMD)存在组间差异。

研究结果表明，虽然外源性SOST提高循环系统SOST水平，并无效抑制骨生成，但不排除SOST的潜在临床价值。PGISp小鼠模型椎间关节SOST表达下调。外源性SOST治疗PGISp小鼠，尚属首次。注射剂量2.5μg并未达到疗效，建议今后的相关研究可增大药物剂量，同时也应观察其安全性和毒性。

总之，本研究基于Wnt信号途径抑制作用，初步应用SOST治疗AS。虽然未改善病情，但仍具有生物活性。今后可借助剂量反映并提高SOST骨靶向能力，实现抑制骨生成。

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Treatment of a mouse model of ankylosing spondylitis with exogenous sclerostin

LIUYa1，ZHANGXiaojun2*

(1.PharmacyofDepartment，ShangluoCentralHospitalofShaanxi，Shangluo726000，China；2.DepartmentofPhysics，SchoolofBiomedicalEngineering，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi′an710032，China)

ObjectiveToevaluatethecurativeeffectofexogenousbonestrengtheningprotein(sclerostin,SOST)forthetreatmentofankylosingspondylitis.MethodsTheproteoglycan(2mg)-inducedspondylitis(PGISp)mousemodelinwhichwepreviouslydemonstrateddownregulatedSOSTexpression，wasusedforthisstudy.Micewereinjectedwith2.5μgrSOST/dayforaperiodof8weeksfollowinginductionofdisease.SamedoseDickkopf1(DKK-1)wasinjectedincontrolgroup，also8weeks.AxialskeletondiseasedevelopmentwasassessedbyhistologyandskeletalchangesexaminedusingDEXA.ResultsSOSTtreatmenthadnoeffectonperipheraloraxialdiseasedevelopment，bonedensityordiseaseseverity.InjectedrSOSTwasstableover8handresiduallevelswereevident24hafterinjection，resultinginacumulativeincreaseinSOSTserumlevelsoverthetreatmenttimecourse.ImmunohistochemicalexaminationofSOSTlevelswithinthejointsincontrolgroupshowedasignificantdecreaseinthepercentageofpositiveosteocytesintheunaffectedjointscomparedtotheaffectedjoints，whilenodifferencewasobservedinSOSTtreatedmice.ThissuggeststhatrSOSTtreatmentincreasesthenumberofSOST-positiveosteocytesinunaffectedjointsbutnotaffectedjoints，despiteofhavingnoimpactonthenumberofjointsaffectedbydisease.ConclusionsAlthoughnotdisease-modifying，rSOSTtreatmentdidappeartoregulateSOSTlevelsinthejointssuggestingbiologicalactivity.FurtherdoseresponsestudiesarerequiredandSOSTmayrequiremodificationstoimproveitsbonetargetingabilityinordertoaffecttissueformationtoameaningfullevelinthismodel.ThecurativeeffectisinferiortoDKK-1.

ankylosingspondylitis；Dickkopf1；sclerostin；boneformation

国家自然科学基金青年基金项目(编号:51377163)

刘亚，女，主管药师

*通信作者：张晓军，男，教授

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.014

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2016-04-21)