鼻咽癌外周血单个核细胞和血浆中EB病毒DNA水平变化及与放化疗疗效的关系

陈岩松，陈　燕，林莺莺，郑瑜宏

福建医科大学教学医院福建省肿瘤医院检验科，福建福州350014

鼻咽癌外周血单个核细胞和血浆中EB病毒DNA水平变化及与放化疗疗效的关系

陈岩松，陈燕，林莺莺，郑瑜宏

福建医科大学教学医院福建省肿瘤医院检验科，福建福州350014

目的比较鼻咽癌患者放化疗治疗前后外周血单个核和血浆EBV DNA水平的动态变化，探讨EBV DNA水平与鼻咽癌放化疗近期疗效的关系。方法采用实时荧光定量PCR方法分别测定整群选取的2015年7—11月福建省肿瘤医院放疗科收治的75例初诊鼻咽癌患者放化疗前后外周血单个核细胞和血浆EBV DNA水平，根据疗效评价分为CR、PR、SD、PD组，各组治疗前后外周血单个核细胞和血浆EBV DNA水平分别进行比较；对配对的75例治疗前鼻咽癌患者外周血单个核细胞和血浆EBV DNA水平进行检出率和相关性分析。结果CR、PR组外周血单个核细胞和血浆EBV DNA治疗前后下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；SD、PD组外周血单个核细胞和血浆EBV DNA治疗前后差异无统计学意义（P＞0.05）。外周血单个核细胞和血浆EBV DNA总体检出率为78.7%、53.3%，差异有统计学意义（P＜0.05）；两种类型标本EBV DNA结果呈正相关（r=0.481，P=0.00）。结论外周血单个核细胞和血浆EBV DNA检测可作为评价鼻咽癌放化疗近期疗效的指标。

EB病毒DNA；外周血单个核细胞；血浆；鼻咽癌；疗效评价

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是恶性程度较高的头颈部肿瘤，其分布具有明显的地区差异，在我国多见于广东、广西、福建等南方地区。鼻咽癌的发病可能是多种因素长期共同作用的结果，其中EB病毒感染是重要的致病因子［1］。EBV DNA是近年来用于鼻咽癌辅助诊断的新指标。中晚期鼻咽癌的治疗主要采用同期放化疗结合辅助化疗［2］，EBV DNA做为鼻咽癌放化疗疗效监测的文献报道较少，该文通过观察初诊2015年7—11月收治的鼻咽癌患者EBV DNA水平在放化疗治疗前后中的动态变化，以探讨EBV DNA做为鼻咽癌放化疗近期疗效判定的可行性，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

研究对象为整群选取福建省肿瘤医院放疗科收治的75例首诊鼻咽癌患者，男55例，女20例，年龄12～75岁，中位年龄48岁。全部病例均经病理活组织检查证实，依照“鼻咽癌2008分期”标准［3］进行临床分期。75例鼻咽癌患者的临床病理资料见表1。同时收集35名健康人群作为治疗前对照。

病理分型I：角化型鳞状细胞癌；II：非角化性癌；III：基底细胞鳞状细胞癌。

1.2治疗方法

所有患者均接受直线加速器根治性放疗，5次/周，总量65～70 Gy。除1例II期患者未行化疗外，其余患者采取顺铂加5-氟尿嘧啶诱导化疗，每3周1次，共2个疗程或铂类单药同步化疗，每3周1次，共3个疗程。所有患者均完成全部治疗计划。

1.3疗效评价

所有患者完成治疗计划后3个月，依据体格检查、鼻咽镜、核磁共振成像等结果进行近期疗效评价，依据WHO实体瘤评价标准分为完全缓解（complete remission，CR）、部分缓解（partial remission，PR）、稳定（stable disease，SD）和进展（progressive disease，PD）组。

1.4EBV DNA检测

所有入组患者治疗前、治疗全部结束后各采集静脉血1次。

1.4.1试剂和仪器采用实时荧光定量PCR方法检测EBV DNA。批号2015007，仪器为美国ABI 7500荧光定量PCR仪。

1.4.2标本处理EDTA抗凝全血2 000 rpm10 min，取上清50 μL血浆备用；另取EDTA抗凝全血加入淋巴细胞分离液（批号20150519-1237），按试剂操作说明书进行外周血单个核细胞（PBMCs）收集。

1.4.3核酸提取及PCR反应将待检PBMCs和血浆分别按照EBV DNA检测试剂盒操作说明书进行核酸提取：50 μL DNA裂解液振荡混匀，100℃干浴10 min，13 000 rpm 5 min，各取2 μL上清进行PCR反应。反应参数：93℃预变性2 min，93℃变性45 s，55℃退火及延伸60 s，10个循环，93℃30 s，55℃45 s，30个循环。同步扩增试剂盒内标准品和质控品，根据标准曲线CT值由仪器分析软件自动计算各样本病毒拷贝数，＞500 copies/mL判为阳性；质控品用于监控反应。

1.5统计方法

使用SPSS 11.0统计软件进行数据处理。EBV DNA阳性率计数资料比较采用χ2检验，EBV DNA在组间的分布以中位数M及四分位数间距（P25，P75）表示，治疗前后EBV DNA的比较采用配对秩和检验；计量资料的相关关系分析采用双变量相关分析（Spearman法），显著性水准为0.05。

表1　75例初诊鼻咽癌患者的基本临床特征［n（%）］

2　结果

①以500 copies/mL为最低检测下限，75例初诊鼻咽癌患者治疗前PBMCs和血浆EBV DNA阳性率分别为78.7%（59/75）、53.3%（40/75），健康对照组PBMCs和血浆EBV DNA阳性率分别为2.8%（1/35）、0（0/35）。鼻咽癌两种类型标本均阳性者有26例，均阴性者有14例，鼻咽癌两种标本阳性率经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。

②相关性分析显示75例首诊鼻咽癌治疗前PBM Cs和血浆来源的EBV DNA结果呈正相关（rs=0.481，P= 0.00），见图1。

表2　不同治疗效果鼻咽癌患者治疗前后EBV DNA拷贝数比较（copies/mL）

图1　血浆和PBMCs EBV DHA拷贝相关性

③75例鼻咽癌患者根据临床疗效分组，各组放化疗治疗前后PBMCs和血浆EBV DNA结果见表2。CR、PR两组治疗前后PBMCs和血浆EBV DNA分别有明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；SD、PD两组治疗前后PBMCs和血浆EBV DNA差异无统计学意义（P＞0.05）。

3　讨论

实时荧光定量PCR具有高灵敏度、准确快速等特点，近年来广泛用于临床病毒学定量检测。传统的鼻咽癌实验室检查以EB病毒壳抗原抗体（VCA-IgA抗体）等相关血清抗原和抗体标志物为主，近年研究认为EB病毒DNA是鼻咽癌早期诊断、鉴别诊断、肿瘤负荷评估、疗效监测的有效指标［4-6］。EB病毒致鼻咽癌的机制可能与其感染后表达潜伏膜蛋白（LMP）编码基因、EB病毒核抗原（EBNA）基因及EBV编码的小RNA（EBER）等有关。鼻咽癌病理类型以非角化型和角化型鳞状细胞癌为主，EBV DNA在其中普遍表达。

EB病毒在B淋巴细胞中增殖使其转化并长期潜伏在淋巴细胞内。Lin［7］通过基因测序发现血浆EBV DNA基因序列与鼻咽原发肿瘤组织EBV DNA序列基本一致，提示血浆EBV DNA来源于鼻咽肿瘤灶并可能反映肿瘤负荷，这也为血浆EBV DNA用于鼻咽癌的辅助诊断、治疗监测提供了依据。中晚期鼻咽癌的治疗主要以同步放化疗序贯辅助化疗或诱导化疗后行同步放化疗，EBV DNA载量用于鼻咽癌放化疗疗效判断在文献中多有报道，这些研究多以血浆做为观察标本。该研究采用荧光定量PCR技术对75例首诊鼻咽癌患者放化疗前后进行EBV DNA的定量检测，同步检测了血浆及外周血单个核细胞（PBMCs）标本。结果显示，EBV DNA阳性率在PBMCs和血浆中分别为78.7%和53.3%，PBMCs阳性率高于血浆。2种类型标本的检测结果呈正相关，和蔡桂君［8］等研究得到的相关性0.664结果相近。PBMCs和血浆标本用于EBV DNA检测优缺点，PBMCs标本检出率高，可以放映EB病毒在体内的现症感染和潜伏感染，但容易受体内白细胞数量波动的影响，不易实现检测标准化；血浆标本操作简便易于标化，但不便于反映潜伏感染。因此实验室如同时提供两种类型标本的检测结果将有利于临床综合判断。

该研究观察了75例首诊鼻咽癌患者放化疗治疗前后PBMCs和血浆EBV DNA水平，在治疗有效组（CR+PR）2种类型标本治疗后EBV DNA水平均有显著下降，而SD和PD组则下降不明显，结果与An X等报道的CR+PR组有64.6%下降率相近［9］。EBV DNA的变化与临床疗效一致，结果进一步支持鼻咽癌对放化疗敏感，并提示EBV DNA可以反映肿瘤细胞增殖情况。

该研究结果表明，EBV DNA载量是鼻咽癌瘤灶增殖的有用指标，可用于鼻咽癌放化疗短期疗效评估的参考，然而其在鼻咽癌转移、复发监测等方面的作用尚待进一步实验研究。

［1］Timothy TC，Roger KC，Ngan，et al.Application of circulating plasma/serum EBV DNA in the clinical management of nasopharyngeal carcinoma［J］.Oral Oncology，2014，50:527-538.

［2］朱婉琳，张九堂.鼻咽癌放化疗综合治疗研究进展［J］.中国医疗前沿，2013，3（8）:25-27.

［3］中国鼻咽癌临床分期工作委员会.鼻咽癌'92分期修订工作报告［J］.中华放射肿瘤学杂志，2009，18（1）：2-6.

［4］Wang WY，Twu CW，Chen HH，et al.Long-Term Survival Analysis of Nasopharyngeal Carcinoma by Plasma Epstein-Barr Virus DNA Levels［J］.Cancer，2013，119（5）：963-70.

［5］Chang XS，Yang SJ.A meta-analysis on the EBV DNA and VCA-IgA in diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma［J］.Pak J Med Sci，2013，29（3）：885-890.

［6］Ferrari.Role of plasma EBV DNA levels in predicting recurrence of nasopharyngeal carcinoma in a western population［J］.BMC Cancer，2012，12：208.

［7］Lin JC，Wang WY，Chen KY，et al.Quantification of plasma Epstein-Barrvirus DNA in patients with advanced nasopharyngeal carcinoma［J］.N EnglJMed，2004，350（24）:2461.

［8］蔡桂君，王瑞莲，赵崇泉.等，淋巴细胞与血浆EB病毒核酸定量结果的关系［J］.广东医学，2014，35（17）:2704-2706.

［9］An X，Wang FH，Ding PR，et al.Plsama Epstein-barr virus DNA level strongly predicts survival in metastatic/recurrent nasopharyngeal carcinoma treated with palliative chemotherapy［J］.Cancer，2011，117（16）：3750-3757.

The Dynamic Change of Peripheral Blood Mononuclear Cell and Plasma Epstein-Barr Virus DNA in Patients with Nasopharyngeal Carcinoma and Correlation with the Radiotherapy and Chemotherapy Curative Effect

CHEN Yan-song，CHEN Yan，LIN Ying-ying，ZHENG Yu-hong
Department of Clinical Laboratory，Fujian Cancer Hospital，Fujian Medical University，Fuzhou，Fujian Province，350014 China

Objective To compare the levels of peripheral blood mononuclear cell and plasma Epstein-barr virus DNA in patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC）before and after radiotherapy and chemotherapy，and to discuss the correlation between the levels of EBV DNA and the short-term curative effect of the radiochemotherapy.Methods Real-time fluorescent quantitative PCR method were determined in 2015 July to November in fujian province tumor hospital radiotherapy was treated 75 cases of nasopharyngeal carcinoma patients before and after the radiation and chemotherapy peripheral blood mononuclear cells and plasma EBV DNA level.Compare the concentrations before and after therapy in CR、PR、SD、PD groups.The relationship was analyzed between plasma and PBMCs EBV DNA.Results CR，PR of peripheral blood mononuclear cells and plasma EBV DNA before and after treatment decreased significantly，the difference was statistically significant（P＜0.05）；SD，PD group of peripheral blood mononuclear cells and plasma EBV DNA before and after treatment there was no statistically significant difference（P＞0.05）.Peripheral blood mononuclear cells and plasma EBV DNA overall detection rate of 78.7%，53.3%，obvious difference（P＜0.05）；Two types of specimens of EBV DNA results were positively correlated（r=0.481，P=0.481）Conclusion Plasma and PBMCs EBV DNA could be used to access the short-term curative effect of NPC with radiotherapy and chemotherapy.

EB virus；Peripheral blood mononuclear cell；Plasma；Nasopharyngeal carcinoma；Curative effect

R739.63

A

1674-0742（2016）09（b）－0001-04

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.26.001

福建省自然基金资助项目（2014J01297）。

陈岩松（1980.6-），男，福建福州人，本科，主管检验师，主要从事临床分子生物学及临床免疫学研究工作。

（2016-06-18）