IDO介导肺癌细胞免疫逃逸的实验研究

李自青，邢雁霞，刘 宏∗

(1.山西大同大学医学院，山西大同037009；2.山西大同大学呼吸病与职业病研究所,山西大同037009)

IDO介导肺癌细胞免疫逃逸的实验研究

李自青1,2，邢雁霞1,2，刘 宏1,2∗

(1.山西大同大学医学院，山西大同037009；2.山西大同大学呼吸病与职业病研究所,山西大同037009)

目的探讨吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）介导肺癌的免疫逃逸机制。方法通过混合培养肺癌细胞A549和T淋巴细胞，RT-PCR检测IDOmRNA在细胞中的表达；以IL-2为细胞刺激因子，有或无1-甲基色氨酸(1-MT)条件下，建立单向淋巴细胞混合反应体系（MLR），MTT法检测T细胞活力，并采用ELISA试剂盒检测IDO活性。结果IDOmRNA在单独培养A549细胞中不表达，在T淋巴细胞中微量表达，而在A549细胞和T淋巴细胞的混合体系中高表达；而且混合单向淋巴细胞反应体系中，IDO的表达能够使T淋巴细胞增殖受到抑制。结论A549细胞在混合培养体系中表达的IDO能有效抑制外周血T细胞增殖，可能参与肺癌免疫逃逸。

吲哚胺2，3双加氧酶；肺癌细胞；免疫逃逸

肺癌是一种严重威胁人类健康和生命的疾病，可诱导机体免疫系统产生免疫耐受，而免疫调节酶吲哚胺2，3双加氧酶（Indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）可能参与了这种免疫耐受。IDO是催化色氨酸在肝脏外沿犬尿酸分解代谢途径的限速酶，参与多种病理生理过程，如自身免疫、感染以及抗肿瘤反应。研究发现IDO在人类多种肿瘤细胞内表达，通过抑制T淋巴细胞的增殖，从而促进肿瘤转移和免疫逃逸，是一种免疫抑制分子[1]。有研究将人白血病细胞与T淋巴细胞共培养后发现，在IL-2的刺激下T淋巴细胞的增殖受到明显抑制，而IDO的特异性抑制剂1-甲基色氨酸(1 methyl Tryptophan，1-MT)能够增强癌细胞对T细胞刺激的敏感性，从而增强外周血T淋巴细胞增殖[2]。本研究在以上研究的基础上，将肺癌细胞A549与T淋巴细胞共培养，观察混合体系中T淋巴细胞在抗肺癌的免疫应答中IDO的作用，来探讨IDO参与的肺癌免疫逃逸机制，从而为临床上治疗肺癌提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

A549细胞购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心，EasySep/人全血CD3＋细胞分选试剂盒购自加拿大StemCell公司，人IDO酶联免疫分析（ELISA）试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，健康人外周血10mL购自大同市血液中心，PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2 细胞的分离培养

将新鲜的健康人外周血用等量生理盐水稀释后，用淋巴细胞分离液（Ficoll，1.077 g/mL）离心（400 r/min，20 min）分离淋巴细胞，用10%FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×107/L。取分离的淋巴细胞，采用EasySep/人全血CD3＋细胞分选试剂盒，免疫磁珠分选的方法，分离出T淋巴细胞，重悬于10%FBS的RPMI1640培养液中备用。

1.3 细胞的混合培养

含10%FBS的RPMI1640培养液中培养A549细胞，增殖状态良好的细胞A549加胰酶进行消化，制备单细胞悬液，然后取1×104细胞A549接种6孔板，12 h后在每孔中分别加1×107T细胞。反应24 h后，每组收集贴壁细胞（A549细胞），洗涤离心后备用。

1.4 IDO的表达

1.4.1 总RNA提取

TRIZOL一步法提细胞总RNA，用紫外分光光度计测A 260/A 280值，鉴定RNA的纯度。

1.4.2 cDNA第一链的合成

5×逆转录缓冲液4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，核糖核酸酶抑制剂1 μL，总RNA 5 μg，寡聚T引物0.5μL，逆转录酶1 μL(200 U)，总体积20 μL。反应条件：42℃水浴90 min，然后70℃水浴10 min。

1.4.3 RT-PCR

根据GenBank中的IDO cDNA序列设计引物[3]。IDO上游引物：5’-GCGCTGTTGGAAATAGCTTC-3’；下游5’-CAGGACGTCAAAGCACTGAA-3’；扩增的片段为234 bp。β-actin为内参，上游引物：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’；下游引物：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’;扩 增 产物268 bp。反应体系：10× PCR buffer 5μL,2 mmol/L dNTP 5 μL，cDNA 2 μL，0.2 μmol/L 上游及下游引物各1 μL,Taq DNA 聚合酶1μl(5 U),25 μmol/L MgCl 2 4 μL，0.2 μmol/L 内参上下游引物各 1 μL，总体积为50 μL；退火温度为60℃进行PCR扩增，产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5 T细胞活力检测

分别取2×104A549细胞和2×105T淋巴细胞，接种96孔板进行单向混合淋巴细胞反应（MLR），并加入200 U/mL的IL-2，同时实验1组加1 mmol/L的1-MT，实验2组不加1-MT。每个实验组设立3个复孔，以1640完全培养液、T淋巴细胞和A549细胞培养作对照。在37℃,5%CO2条件下培养72 h，加MTT液（5 mg/mL）20 μL，再培养6 h，离心弃上清，加100 μL DMSO震荡5 min，在490 nm处测定吸光度(A)值。T细胞增殖率(%)=(实验组A值/对照组A值-1)×100%。

1.6 IDO活性检测

从MLR混合体系中收集A549细胞，用PBS（pH 7.2～ 7.4）稀释至1× 106，3 000 r/min，离心20 min，收集上清。用ELISA试剂盒检测IDO活性，操作按说明书进行。

1.7 统计处理

用SPSS13.0对数据进行处理,以均数±标准差表示每组数据，组间比较用LSD检验，P=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 IDOmRNA表达

经RT-PCR检测，结果表明IDOmRNA在单独培养的A549细胞中不表达，在T淋巴细胞中少量表达，而在混合体系中A549细胞高表达IDOm-RNA（见图1）。

图1 细胞中IDO mRNA的表达

2.2 T淋巴细胞的细胞毒活力检测

单向MLR培养观察T细胞的增殖结果表明，在生长因子IL-2刺激下，单独培养的T淋巴细胞增殖率为(62.4±3.2)%。无1-MT时，混合培养MLR体系中T淋巴细胞增殖率为(20.1±3.4)%；有1-MT时，共培养MLR体系中T淋巴细胞增殖率为(58.3±2.4)%，二者比较差异显著(P＜0.05)。

2.3 IDO活性检测

IDO活性检测结果显示，无1-MT的MLR体系中IDO活性为(60.2±8.2)%；加入1-MT后，IDO活性为(15.1±3.2)%，二者比较差异显著(P＜0.05)。单独T淋巴细胞培养检测不到IDO活性。

3 讨论

目前，肺癌的治疗主要采用手术、放疗及化疗，研究显示IDO能介导肿瘤细胞对抗γ辐射、顺铂和奥拉帕尼，而IDO在肺癌组织以及非恶性增殖的肺癌组织中呈现高表达，在肺癌细胞系中表现为低表达，导致肺癌患者预后不良[4]。有研究发现部分肿瘤细胞能够高表达IDO，从而抑制了局部T淋巴细胞的增殖，使肿瘤细胞能够逃避免疫系统攻击[5]。康璇等研究IDO介导肝癌细胞HepG2的免疫逃逸，发现HepG2表达的IDO能抑制外周T淋巴细胞的增殖从而发挥其抗肿瘤免疫的作用[6]。唐晓琼等探讨了IDO在白血病细胞中的表达，结果显示白血病细胞表达的IDO活性能抑制外周T淋巴细胞增殖[7]。

本研究结果进一步证实了在肺癌细胞A549和T淋巴细胞的混合培养体系中，肺癌细胞高表达的IDO活性能够抑制外周T淋巴细胞增殖，可能参与了肺癌免疫耐受；而IDO特异性抑制剂1-MT能降低IDO活性，从而促进外周血T细胞增殖。这一研究可能为肺癌的临床免疫治疗提供新的思路。

[1]Friberg M,Jennings R,Alsarraj M,et al.Indoleamine 2,3-dioxygenase contributes to tumor cell evasion of T cell-mediated rejection[J].Int J Cancer,2002,101(2)：151-155.

[2]Muller A J,DuHadaway J B,Donover P S,et al.Inhibition of indoleamine 2,3-dioxygenase,an immunoregulatory target of the cancer suppression gene Bin1,potentiates cancer chemotherapy[J].Nat Med,2005,11(3)：312-319.

[3]Que Z,Zou F,Zhang A,et al.Ganoderic acid Me induces the apoptosis of competent T cells and increases the proportion of Treg cells through enhancing the expression and activation of indoleamine 2,3-dioxygenase in mouse lewis lung cancer cells[J].Int Immunopharm-acol,2014,23(1)：192-204.

[4]Li R,Wei F,Yu J,et al.IDO inhibits T-cell function through suppressing Vav1 expression and activation[J].Cancer Biol Ther,2009,8(14)：1402-1408.

[5]Suwa S,Kasubata A,Kato M,et al.The tryptophan derivative,tranilast,and conditioned medium with indoleamine 2,3-dioxygenaseexpressing cellsinhibit the proliferation of lymphoid malignancies[J].Int J Oncol,2015,46(3)：1369-1376.

[6]康璇,王琦,杨洁.吲哚胺2,3-双加氧酶介导肝癌细胞免疫逃逸的实验研究[J].中国生物工程杂志,2008,28(5)：12-16.

[7]唐晓琼,赵智刚,王红祥,等.急性髓细胞白血病细胞的吲哚胺2,3-双加氧酶介导免疫逃逸的实验研究[J].中国实验血液学杂志,2006,14(3)：539-542.

〔责任编辑 杨德兵〕

Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity in lung cancer Cells Contributing to Tumor Immune Escape

LI Zi-qing1,2,XIN Yan-xia1,2,LIU Hong1,2∗
(1.Medical School,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009；2.Respiratory and Occupational Disease Research Institute,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009)

Objective Investigating the immune escape mechanism of 2-and 3-(IDO)-mediated lung cancer.Methods Lung cancer A549 cells and T lymphocytes were mixed culture and IDOmRNA expression was detected by RT-PCR;Then one-way lymphocytes mixed reaction(MLR)was carried out,cytokines IL-2 was used as stimulation in culture without or with 1-MT.MTT assay was used to detect the viability of T cells and IDO activity in ELISA kit.Results IDO expression was not found in A549 cells cultured alone,was expression of trace in T-lymphocyte,but IDO expression in mixed system of A549 cell A,and expression levels were separately cultured T lymphocytes.In mixed lymphocyte reaction of one-way,the expression of IDO can inhibit the proliferation of T lymphocytes.Conclusions The expression of IDO in mixed culture of A549 cells can inhibit the proliferation of T cells in peripheral blood,which may lead to immune escape of lung cancer.

Indoleamine 2,3-dioxygenase;lung cancer;immune escape

R734.2

A

1674-0874(2016)03-0048-03

2016-03-28

大同市科技攻关计划项目[201361]

李自青(1980-)，女，硕士，讲师，研究方向：分子生物学与肿瘤免疫学。*刘宏，男，博士，教授，通信作者。