猪肺炎支原体高密度发酵工艺的研究

朱秀同 高晓磊 张德宝 柳 珊 郁宏伟 李晓艳 刘 涛

猪肺炎支原体高密度发酵工艺的研究

朱秀同 高晓磊 张德宝 柳 珊 郁宏伟 李晓艳 刘 涛

（瑞普（保定）生物药业有限公司，河北保定 071000）

为提高猪肺炎支原体发酵培养的滴度，在500L发酵罐基础上，对猪肺炎支原体J株的发酵工艺进行了一系列优化试验，各项发酵培养条件经优化后，发酵支原体的滴度得到了明显提高，发酵滴度可达到1×109CCU/ml以上，本研究为提供高效、安全和稳定的猪肺炎支原体疫苗产品奠定基础。

猪肺炎支原体；发酵工艺；优化

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是引起猪支气管肺炎（Mycoplasmal pneumoniae of swine，俗称猪气喘病）的主要病原。该病广泛存在于世界各国，严重危害着养猪事业的发展。猪只感染后除导致饲料转化率降低生长发育不良外，且易继发病毒或细菌感染，造成猪死亡率升高，导致经济损失惨重［1］，疫苗免疫是预防本病最重要的手段。

肺炎支原体的培养条件非常苛刻，是疫苗规模化生产的工艺难题。影响猪肺炎支原体发酵的因素非常多，如支原体生长所需的营养物质、接种密度、培养时间、培养基的pH值搅拌转速以及通气量等等。我们选用免疫原性良好的J株进行了发酵工艺研究，测定了其在不同培养时期的菌液滴度，明确了该菌株在适宜培养基中的生长趋势变化；并对各影响参数进行优化以有效提高疫苗的生产效率。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种 猪肺炎支原体J株

1.1.2培养基 据A26培养基配方成分，经瑞普（保定）生物药业有限公司研发部改进

1.1.3主要设备500L发酵罐

1.2方法

猪肺炎支原体J株培养条件的优化设计按照单个变量顺次进行，共进行了以下几个参数的优化，根据发酵结束时支原体滴度的变色单位（Colour Change Unit，CCU）结果判定优化效果。

1.2.1培养时间的优化 在500L发酵罐中进行，培养基体积为300L，培养基初始pH值调为7.5，将生长稳定的二级种子液按照10%接种，37℃培养，转速设定为100r/min，培养32h、40h、48h、56h各取样1次，分别进行CCU测定。

1.2.2局种密度的优化 在500L发酵罐中进行，培养基体积为300L，培养基初始pH值调为7.5，将生长稳定的二级种子液按照1%，5%，10%和15%接种量接种到发酵罐中，37℃培养，转速设定为100r/min，培养40h取样，分别进行CCU测定。

1.2.3pH值的优化 按照5%接种量在500L发酵罐中进行，培养基体积为300L，培养基初始pH值调为7.0、7.5、7.8和8.0，37℃培养，37℃培养，转速设定为100r/min，培养40h取样，分别进行CCU测定。

1.2.4转速的优化 按照5%接种量在500L发酵罐中进行，培养基体积为300L，培养基初始pH值调为7.5，转速分别设定为50r/ min、100r/min、200r/min，37℃培养，培养40h取样，分别进行CCU测定。

1.2.5通气量的优化 按照5%接种量在500L发酵罐中进行，培养基体积为300L，培养基初始pH值调为7.5，转速设定为100r/ min，37℃培养。通气方式分3种，分别为发酵前一次性补加、100L/min固定不变和200L/min固定不变，各培养40h取样，分别进行CCU测定。

2 结果与分析

2.1培养时间的优化

不同培养时间的支原体计数结果显示，40h为最佳培养时间，过早或过晚停止发酵培养物滴度均偏低（见表1），发酵后40h可能猪肺炎支原体正处于对数生长期，尚未进入衰退期，所以滴度相对较高。

表1　培养时间对猪肺炎支原体生长的影响

2.2接种密度的优化

本研究结果显示，接种密度对猪肺炎支原体产生较大影响，5%-10%的接种量比较适宜（表2）。过低的接种密度会导致支原体生长过慢，过高则会使营养物质早期大量消耗，致使支原体生长提前进入衰亡期。

表2　接种密度对猪肺炎支原体生长的影响

2.3pH值的优化

本研究结果显示，发酵前培养基的pH值对猪肺炎支原体发酵有重要影响，pH值在7.5～7.8范围内所得菌数较高，为最适pH值范围（见表3）。pH值过低或过高均达不到良好的效果。

表3　pH值对猪肺炎支原体生长的影响

2.4转速的优化

本研究结果显示，不同搅拌转速对猪肺炎支原体发酵有重要影响，100rpm为最适宜转速，过低生长速度较慢，过高则导致菌体大量死亡（见表4）。

表4　转速对猪肺炎支原体生长的影响

2.5通气量的优化

本研究结果显示，通气量的改变对猪肺炎支原体生长无明显影响（见表5）。

表5　通气量对猪肺炎支原体生长的影响

3 讨论与小结

针对不同菌种和不同用途的发酵都需要对影响发酵的各项参数进行综合考虑，只有对发酵条件进行全面优化才能达到预期的效果。发酵罐体积不同，发酵时各项参数对猪肺炎支原体培养滴度的影响也不同，不能照搬其它发酵研究的结果。本研究对猪肺炎支原体J株的培养时间、接种密度、pH值、转速和通气量等5项发酵参数进行了优化试验，基本确定了在500L发酵罐上的发酵培养方式，即发酵时选择加入5%的二级种子液、调节培养基pH值7.5～7.8、转速100rpm，发酵前补入足量灭菌空气，发酵40h后即可收获，本研究为为提升发酵培养效率和过程控制提供了重要依据。

值得指出的是，由于猪肺炎支原体培养极为困难，人们通常认为10%的接种量为最佳接种量，本研究结果证明5%的接种量即可保证发酵的成功，过高的接种密度不仅会造成种子的浪费，而且会使营养物质在培养早期便大量消耗，致使细菌生长提前进入衰退期。

本研究中用到的滴度测定方法为CCU法，该方法是以微生物在培养基中的代谢活力为指标来计算微生物的含量的，研究中，我们采用该法对培养菌液进行2次重复计数，取平均值为最终结果。与PCR等快速判断的方法相比，CCU法虽然具有耗时长的缺点（10d），但其数据可靠，操作简便，可重复性强，重要的是CCU法反映的是活菌滴度，因此是大生产中最可靠的计数方法，本研究为瑞普生物生产高效、安全和稳定的猪肺炎支原体灭活疫苗产品奠定了基础。

［1］ RF Ross Mycoplasma Disease. Swine Disease［M］.Iow a State University press，1986：469-483.

朱秀同（1981-），硕士学历，兽医师，主要从事兽用生物制品方面研究。

保定市莲池区科技计划项目（2016-07）