HPLC法同时测定参菊洗剂中4种成分的含量Δ

谭 璐，张广求，刘 文（黄冈市中心医院药剂科，湖北黄冈 438000）

HPLC法同时测定参菊洗剂中4种成分的含量Δ

谭 璐＊，张广求#，刘 文（黄冈市中心医院药剂科，湖北黄冈 438000）

目的：建立同时测定参菊洗剂中苦参碱、蒙花苷、盐酸小檗碱和蛇床子素含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Dionex C18，流动相为乙腈-0.1%三乙胺水溶液（用磷酸调节pH至7.2）（梯度洗脱），流速为1.0 ml/min，检测波长为210 nm，柱温为30℃，进样量为20 μl。结果：苦参碱、蒙花苷、盐酸小檗碱和蛇床子素检测进样量线性范围分别为1.400～8.400 μg（r=0.999 4）、0.152～0.912 μg（r=0.999 6）、0.248～1.488 μg（r=0.999 9）、0.128～0.768 μg（r=0.999 4）；定量限分别为84.85、3.15、15.03、7.76 ng，检测限分别为24.13、0.89、4.27、2.20 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2%；加样回收率分别为96.29%～99.06%（RSD=1.10%，n=9）、96.49%～98.27%（RSD=0.69%，n=9）、99.26%～101.13%（RSD=0.62%，n=9）、96.27%～98.64%（RSD=0.89%，n=9）。结论：该方法操作简便、结果准确、重复性好，可用于同时测定参菊洗剂中苦参碱、蒙花苷、盐酸小檗碱和蛇床子素的含量。

参菊洗剂；苦参碱；蒙花苷；盐酸小檗碱；蛇床子素；高效液相色谱法；含量测定

参菊洗剂是黄冈市中心医院自主研制并在临床应用多年的中药制剂（批准文号：鄂药制字Z20110230），由苦参、野菊花、黄柏、蛇床子等12味中药材组成，具有消炎、止痒、除秽、杀菌等功效，可用于细菌性、真菌性、滴虫性阴道炎及多种皮肤瘙痒症，疗效较好［1］。方中苦参为君药，野菊花、黄柏、蛇床子为主要药材。苦参具有抗滴虫作用，对痢疾杆菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用；野菊花对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠埃希菌及多种致病性杆菌、皮肤真菌均有一定抗菌作用；黄柏有杀灭阴道滴虫作用，对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和多种致病性皮肤真菌均有抑制作用；蛇床子有抗滴虫作用，对絮状表皮癣菌、石膏样小芽胞菌、羊毛状小芽胞菌有抑制作用［2］。参菊洗剂收录于2011年版《湖北省医疗机构制剂规范》中，该制剂规范只采用薄层色谱法对苦参、野菊花、黄柏、蛇床子进行定性鉴别，而没有对其进行含量测定。因此，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）建立了同时测定参菊洗剂中苦参、野菊花、黄柏、蛇床子中的有效成分苦参碱、蒙花苷、盐酸小檗碱和蛇床子素含量的方法，以期为更好地控制该制剂的质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Ultimate 3000型HPLC仪，包括Ultimate 3000泵、Ultimate 3000紫外检测器、UltiMate 3000 WPS自动进样器、Chromeleon高效液相数据处理系统（美国Dionex公司）；FA1604型万分之一电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；pHs-3C型pH计（杭州奥立龙仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

参菊洗剂（黄冈市中心医院自制，批号：141105、141201、150209，规格：500 ml/瓶）；苦参碱对照品（批号：110805-200508，纯度：99.80%）、蒙花苷对照品（批号：111528-201308，纯度：99.50%）、盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201212，纯度：99.00%）、蛇床子素对照品（批号：110822-201308，纯度：99.00%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，乙酸乙酯、三乙胺、磷酸、氨水均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Dionex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%三乙胺水溶液（用磷酸调节pH至7.2）（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 ml/min；检测波长：210 nm；柱温：30℃；进样量：20 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取苦参碱对照品0.017 5 g、蒙花苷对照品0.001 9 g、盐酸小檗碱对照品0.003 1 g、蛇床子素对照品0.001 6 g，置于同一25 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制成质量浓度分别为700、76、124、64 μg/ml的混合对照品溶液。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Conditions of gradient elution

2.2.2 供试品溶液 精密量取样品5 ml，置于分液漏斗中，用氨水调节pH至9.3，加乙酸乙酯置于分液漏斗中，振摇提取3次，每次20 ml，合并乙酸乙酯提取液，挥干，残渣加甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按样品的处方比例和制备工艺，分别制备不含苦参、野菊花、黄柏和蛇床子的阴性样品，然后按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以苦参碱峰计＞2 000，保留时间为20 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液1、2、3、4、5、6 ml，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，制成系列线性溶液。取上述溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得苦参碱、蒙花苷、盐酸小檗碱和蛇床子素的回归方程与线性范围，见表2。

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限（LOQ）；当信噪比为3∶1时，得检测限（LOD），结果见表3。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，苦参碱、蒙花苷、盐酸小檗碱和蛇床子素峰面积的RSD分别为0.41%、0.37%、0.58%、0.66%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，苦参碱、蒙花苷、盐酸小檗碱和蛇床子素峰面积的RSD分别为0.89%、0.77%、1.15%、1.23%（n=7），表明供试品溶液在室温下12 h内稳定性良好。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.缺苦参的阴性对照；D.缺野菊花的阴性对照；E.缺黄柏的阴性对照；F.缺蛇床子的阴性对照；1.苦参碱；2.蒙花苷；3.盐酸小檗碱；4.蛇床子素Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control without Sophora flavescens；D.negative control without Chrysanthemum indicm；E.negative control without Phellodendron chinese；F.negative control without Cnidium monnieri；1.matrine；2.linarin；3.berberine hydrochloride；4.osthole

表2 回归方程与线性范围Tab 2 Regression equations and linear ranges

表3 定量限与检测限测定结果Tab 3 Determination results of quantitation limit and detection limit

2.8 重复性试验

取同一批样品（批号：150209）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，苦参碱、蒙花苷、盐酸小檗碱和蛇床子素的平均含量分别为297.76、10.88、47.33、11.06 μg/ml；RSD分别为0.69%、0.85%、1.00%、0.91%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密量取已知含量的样品（批号：141105）适量，共9份，分别加入低、中、高质量的苦参碱、蒙花苷、盐酸小檗碱和蛇床子素对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表4。

表4 加样回收率试验结果（n=9）Tab 4 Results of recovery tests（n=9）

2.10 样品含量测定

取3批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算苦参碱、蒙花苷、盐酸小檗碱和蛇床子素的含量，结果见表5。

表5 样品含量测定结果（n=3，μg/g）Tab 5 Results of contents determination of samples（n=3，μg/g）

3 讨论

3.1 测定波长的选择

苦参碱的检测波长主要为210［3］、220［4-5］、230 nm［6］等，蒙花苷的检测波长为268、334 nm［7］，盐酸小檗碱的检测波长为228、264、346 nm［8］，蛇床子素的检测波长为206［9］、322 nm［10］。笔者尝试在不同检测波长处测定参菊洗剂中4种待测成分，结果在210 nm波长处，4种成分均有较好的响应值，且其他杂质干扰较小，故本试验选择210 nm为检测波长。

3.2 提取溶剂的考察

预试验时，笔者考察了甲醇、乙醚、乙酸乙酯作为提取溶剂。结果，相同提取条件下，乙酸乙酯提取率最高，故本试验选择乙酸乙酯作为提取溶剂。为确定最佳提取溶剂体积和提取次数，笔者选用乙酸乙酯30、20、15 ml/次分别振摇提取3次或者4次，以峰面积比较提取效果。结果，乙酸乙酯20 ml/次振摇提取3次即可有效提取出样品中4种待测成分，故本试验选择乙酸乙酯的提取体积为20 ml/次，提取次数为3次。

3.3 流动相的选择

笔者参考相关文献［11-15］，考察了乙腈-不同浓度磷酸溶液、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾水溶液和乙腈-0.1%三乙胺水溶液（磷酸调节不同pH）等不同流动相进行等度和梯度洗脱。结果，以乙腈-0.1%三乙胺水溶液（磷酸调节pH至7.2）梯度洗脱效果最佳，各色谱峰峰形、分离度均较好且基线较平稳。因此，本试验选择乙腈-0.1%三乙胺水溶液（磷酸调节pH至7.2）为流动相，洗脱方式为梯度洗脱。

综上所述，本方法简便、准确，重复性好，可用于同时测定参菊洗剂中苦参碱、蒙花苷、盐酸小檗碱和蛇床子素的含量。

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［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：202-203.

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［9］杨娟，黄敬群.除湿止汗散的制备及质量控制［J］.中国医院药学杂志，2011，31（2）：154.

［10］黄良永，郑江萍，甘春英.独活药材及其配方颗粒中蛇床子素的含量比较［J］.医药导报，2010，29（1）：90.

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［12］唐春丽，陆石英，覃文慧，等.多波长HPLC法同时测定清胃黄连片中4种成分的含量［J］.中药材，2014，37（6）：1 062.

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Simultaneous Determination of Four Components in Shenju Lotion by HPLC

TAN Lu，ZHANG Guangqiu，LIU Wen（Dept.of Pharmacy，Huanggang Central Hospital，Hubei Huanggang 438000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of matrine，linarin，berberine hydrochloride and osthole in Shenju lotion.METHODS：HPLC was performed on the column of Dionex C18with mobile phase of acetonitrle-0.1%triethylamine（pH was adjusted to 7.2 with phosphoric）（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 210 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 1.400-8.400 μg for matrine（r=0.999 4），0.152-0.912 μg for linarin（r=0.999 6），0.248-1.488 μg for berberine hydrochloride（r=0.999 9）and 0.128-0.768 μg for osthole（r=0.999 4）；limit of quantitation was 84.85，3.15，15.03，7.76 ng，limit of detection was 24.13，0.89，4.27，2.20 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 96.29%-99.06%（RSD=1.10%，n=9），96.49%-98.27%（RSD=0.69%，n=9），99.26%-101.13%（RSD=0.62%，n=9）and 96.27%-98.64%（RSD=0.89%，n=9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for the simultaneous determination of matrine，linarin，berberine hydrochloride and osthole in Shenju lotion.

Shenju lotion；Matrine；Linarin；Berberine hydrochloride；Osthole；HPLC；Content determination

R282.71；R927.2

A

1001-0408（2016）30-4257-04

2015-11-27

2016-08-13）

（编辑：刘 柳）

黄冈市科技计划项目（No.黄科〔字2013〕76号）

＊主管药师，硕士。研究方向：医院药学、药物分析。电话：0713-8625312。E-mail：tanlu05@126.com

#通信作者：副主任药师。研究方向：医院药学、药物分析。E-mail：ccnpa@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.26