葛根素对大鼠酒精性肝纤维化的干预作用以及对肝星状细胞增殖活化的影响*

郝原青，郭晓雪，丁雅珊，王任远，苏剑清，常淼花，杜静，苏金玲

（天津中医药大学中西医结合学院，天津　300193）

·学生园地·

葛根素对大鼠酒精性肝纤维化的干预作用以及对肝星状细胞增殖活化的影响*

郝原青，郭晓雪，丁雅珊，王任远，苏剑清，常淼花，杜静，苏金玲

（天津中医药大学中西医结合学院，天津300193）

［目的］研究葛根素对大鼠酒精性肝纤维化的干预作用以及对肝星状细胞增殖活化的影响。［方法］Wistar雄性大鼠85只被随机分为正常对照、模型、葛根素低、中、高剂量和阳性药（易善复）对照6组。除正常对照组之外，其余给予大鼠灌胃白酒辅以玉米油、吡唑的混合食料制备酒精性肝纤维化模型，12周后采用苏木精-伊红（HE）、Masson染色观察大鼠肝脏组织纤维化状况。采用免疫组化法检测大鼠肝组织内增殖细胞核抗原（PCNA）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，根据PCNA的表达，计算肝细胞的增殖指数。［结果］模型组和各给药组肝纤维化程度显著高于正常对照组，各给药组肝纤维化程度要轻于模型组，但低剂量组肝纤维化程度重于其他各给药组。模型组肝细胞增殖指数明显高于其他各组，各给药组肝细胞增殖指数高于正常组。模型组α-SMA的表达高于其他各组，葛根素中、高剂量组和阳性药组α-SMA的表达低于模型组，葛根素低剂量组α-SMA的表达与模型组没有显著性差异，但从数据趋势上看低于模型组。［结论］葛根素能通过抑制肝星状细胞的增殖活化从而达到防治酒精性肝纤维化的功效，以中、高剂量效果更明显。

葛根素；酒精性肝纤维化；肝星状细胞；增殖细胞核抗原；α-平滑肌肌动蛋白

近年来，随着中国经济的发展，人们生活方式的转变，酗酒导致的酒精性肝病（ALD）的发病率迅猛增长，已经成为中国继病毒性肝炎之后常见导致肝脏疾病的又一大原因［1］，严重危害人类健康，对ALD的发病机制也日益成为研究的热点［2-4］。酒精性肝病初期通常表现为脂肪肝、酒精性肝炎，尤以脂肪肝最为突出［5］，后期可发展为肝纤维化甚至肝硬化［6］。

肝星状细胞（HSC）是肝内的贮脂细胞，正常情况下表现为富含脂滴的静止状态，当乙醇进入体内后，乙醛作为乙醇的直接代谢产物，是激活HSC并导致酒精性肝纤维化发生的关键分子［7］。肝脏受损，HSC被活化，它的激活又是肝纤维化发生的中心环节［8-9］。其中酒精性肝纤维化（AHF）是肝硬化的必经阶段，由于此阶段的可逆状态，因此，预防和抑制其发生和发展引起广大医学者的重视。

葛根是传统解酒中药，而葛根素是主要活性成分，有研究表明，其有防治酒精性肝病的功效［10-11］。本文进一步探讨其防治酒精性肝纤维化的作用，并研究对HSC增殖活化的影响，从而深入探讨其发挥作用的可能机制，为临床应用和药物开发奠定理论基础和实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物Wistar雄性大鼠85只，体质量200g左右，SPF级，购自于中国人民解放军军事医学科学院，许可证号：SCXK-（军）2009-0003。

1.2主要实验试剂与器材葛根素片（广州侨光制药有限公司），易善复［赛诺菲安万特（北京）制药有限公司］，62°牛栏山二锅头：北京顺鑫农业股份有限公司，吡唑：上海晶纯试剂有限公司，小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原（PCNA）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体、Sp-9002、DAB显色试剂盒、Masson三色染液均购自天津碧生源生物技术有限公司。

1.3实验分组与模型制备大鼠适应性饲养1周后按随机数字表法分为正常对照组10只、其他各组各15只。除正常对照组外，其他各组大鼠每日早晚2次予以62°二锅头酒10 mL/（kg·d）、玉米油2 mL/（kg·d）、吡唑25 mg/（kg·d）混合物灌胃［12］，正常对照组则每日早晚予以相应剂量的生理盐水灌胃。葛根素低、中、高剂量组和阳性药对照组早晚灌胃之间分别给予葛根素片溶液6.25、13.5、27 mg/（kg·d）和易善复0.12 g/（kg·d）溶液灌胃，正常对照组和模型组给予相应剂量生理盐水灌胃。6组大鼠均饲以全价营养颗粒饲料，自由进食饮水。模型的制备时间为12周［13］。

1.4取材造模12周后，处死大鼠迅速剖腹取出肝脏，取各组大鼠肝右叶中间相同部分组织以4%甲醛溶液固定。

1.5指标观察和检测

1.5.1HE和Masson染色观察观察各组大鼠肝纤维化的情况，可见胶原纤维沿窦周隙延伸并伴有纤维结缔组织增生［14］。Masson染色把肝组织中的纤维染成绿色，应用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件进行分析，计算纤维所占面积的百分比。

1.5.2肝细胞增殖指数的观察采用免疫组化法（SP法）进行PCNA染色。PCNA阳性定位在肝细胞核，增殖细胞核呈棕黄色［15］。观察不少于5个高倍视野（400倍），记数至少500个细胞。以增殖指数反映肝细胞增殖程度。

计算公式：增殖指数=PCNA阳性细胞数/细胞总数×100%

1.5.2SP法检测大鼠肝组织α-SMA的表达采用SP法进行染色。结果判定：阳性部位定位于胞浆，主要集中于肝脏组织汇管区，以纤维间隔中最为明显。于光镜高倍视野下，每张切片随机选取5个互不重叠视野，应用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件进行分析，测定每个视野的阳性细胞面积，取其平均值。

1.6统计学方法统计学分析采用SPSS 18.0统计软件包进行，结果以均数±标准差（±s）表示，各组数据比较采用方差分析方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠状态和死亡情况正常对照组大鼠一般情况良好，毛色光泽，精神活泼，至造模结束无死亡，模型组大鼠精神萎靡，嗜睡，体质量增长缓慢，体毛蓬乱，个别有脱毛现象。各给药组大鼠情况好于模型组。模型组、葛根素低、中、高剂量和阳性药对照组因灌胃乙醇呛入气管、慢性乙醇中毒等原因分别死亡7、8、7、8、8只大鼠。

2.2HE染色观察各组大鼠肝组织一般形态正常对照组大鼠肝组织中肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，中央静脉周围未见纤维组织增生，门管区未见增宽。模型组大鼠肝组织中可见点状坏死，个别肝细胞发生脂肪变性。中央静脉周围可见少量纤维组织增生，门管区稍增宽，可见少量纤维穿插进入肝小叶。其他各给药组情况好于模型组。

2.3Masson染色观察各组大鼠肝组织纤维化程度模型组和各给药组大鼠肝组织纤维化面积均大于正常对照组，各给药组大鼠肝组织纤维化面积均小于模型组，但葛根素低剂量组要大于其他各给药组，葛根素中、高剂量和阳性药对照组大鼠肝组织纤维化面积没有显著差异，见表1。

2.4葛根素对酒精性肝纤维化大鼠肝组织增殖指数的影响模型组和各给药组大鼠肝组织增殖指数高于正常对照组，各给药组增殖指数低于模型组，但是葛根素中、高剂量和阳性药对照组增殖指数低于葛根素低剂量组，见表1。

2.5葛根素对酒精性肝纤维化大鼠肝组织α-SMA表达的影响模型组和各给药组大鼠肝组织α-SMA的表达高于正常对照组，葛根素中、高剂量组和阳性药对照组α-SMA的表达低于模型组，葛根素低剂量组α-SMA的表达和模型组差异无统计学意义，但从数据趋势上看低于模型组。见表1。

表1　葛根素对酒精性肝纤维化大鼠肝组织纤维化程度和α-SMA表达以及增殖指数的影响（±s）

表1　葛根素对酒精性肝纤维化大鼠肝组织纤维化程度和α-SMA表达以及增殖指数的影响（±s）

注：与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.01，**P＜0.05。

组别n纤维化程度（%）α-SMA（area）增殖指数（%）正常对照组101.89±0.4636 476.90±7 770.434.87±1.78模型组87.65±0.83#121 539.00±50 298.46#39.46±5.97#葛根素低剂量组75.29±0.66#*99 522.43±5 197.82#31.68±6.18#*葛根素中剂量组83.71±0.60#*63 310.38±10 342.03##*23.25±7.38#*葛根素高剂量组73.36±0.46#*61 823.86±8 782.41##*24.75±3.55#*阳性药对照组73.27±0.53#*60 633.43±6 994.33##*25.32±4.20#*

3　讨论

近年来，随着大量饮酒人员数量的增长，ALD已经成为高发的肝病之一。ALD中后期可逐渐出现肝纤维化，如果及时治疗，肝纤维化程度还可以减轻甚至逆转，但如果逐渐加重，就会发展为不可逆转的肝硬化，给患者带来极大痛苦甚至威胁生命，因此，如何减轻甚至逆转AHF是目前学者研究的一个重点［16］。目前，学者发现乙醇可通过不同的机制可以造成肝损伤，致使肝细胞变性甚至死亡，肝细胞从再生能力讲属于稳定性细胞，生理状态下不进行再生，但当一部分肝细胞死亡后，其周围存活的肝细胞会展现强大的增殖能力，通过再生进行修复，弥补一部分肝细胞死亡给肝造成的损伤，因此可以通过检测肝细胞的增殖情况，间接揭示肝细胞的损伤程度。PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标［17］。本研究通过检测大鼠肝细胞PCNA的表达，进而计算肝细胞增殖指数，来反映乙醇对大鼠肝组织的破坏程度。大量肝组织破坏，会通过不同机制促进间质纤维组织增生，但不管何种机制，最终殊途同归均是通过使HSC增殖活化，转变为肌成纤维细胞，进而产生纤维组织，从而发生肝纤维化［18］。而α-SMA是HSC增殖活化的主要标志蛋白，与HSC活化的程度及数量呈正相关［19-20］。

中医没有AHF这个病名，多数学者认为酒精性肝纤维化的辨证应属于中医“酒癖”的范畴，《诸病源候论》曰：“酒性有毒，而复大热，饮之过多，故毒热气渗溢经络，浸溢腑脏，而生诸病也。”认为大量饮酒能够助生湿热之邪，长时间大剂量饮酒则使湿热酒毒内蕴，这是其主要发病病机。葛根为豆科植物野葛的根，其味辛、甘，性凉，入胃、脾二经，可以解酒醒脾，《本草正义》称葛根“最能开发脾胃清阳之气”［21］，自古以来，中医把葛根作为解酒毒的主要药物之一。葛根素为葛根的主要活性成分之一，现代医学发现其对ALD有防治功效［10］，但对AHF的功效研究较少，具体发挥作用的机制更是不甚清楚。因此本实验进一步验证葛根素是否具有防治AHF化的功效，并以HSC活化为切入点，通过揭示葛根素对HSC增殖活化是否具有影响，进一步揭示其发挥作用的可能机制。

本研究发现，模型组和各给药组的大鼠肝纤维化程度显著高于正常对照组，而各给药组大鼠肝脏纤维化程度轻于模型组，低剂量组肝纤维化程度重于其他各给药组，而模型组增殖指数显著高于其他各组，葛根素中、高剂量和阳性药对照组增殖指数低于葛根素低剂量组，综上可以得出结论葛根素有防治酒精肝纤维化的功效，中、高剂量的效果要好于低剂量。实验结果进一步揭示模型组和其他各给药组α-SMA的表达均高于正常对照组，葛根素中、高剂量组α-SMA的表达低于模型组，葛根素低剂量组α-SMA的表达与模型组相比虽然没有显著性差异，但从数据趋势上仍然低于模型组。因此，葛根素可能通过抑制α-SMA的表达，从而抑制HSC的增殖活化，有效地延缓了AHF的发展进程，且以中、高剂量效果更加明显。而葛根素中、高剂量和阳性药对照组大鼠肝组织纤维化面积及α-SMA的表达没有显著差异，与阳性药防治效果相近，但由于葛根素的价格较低，毒副作用较少，亦可以考虑其作为治疗酒精性肝纤维化的常用药物，但其防治酒精性肝纤维化的深入机制还有待后续实验进一步研究。

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Effects of puerarin on proliferation activation of hepatic stellate cell in rats with alcoholic liver fibrosis

HAO Yuan-qing，GUO Xiao-xue，DING Ya-shan，WANG Ren-yuan，SU Jian-qing，
CHANG Miao-hua，DU Ging，SU Jin-ling
（School of Combination of TCM and WM，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To research the intervention effect of puerarin on alcoholic liver fibrosis in rats and the effects on the proliferation activation of hepatic stellate cell.［Methods］Eight-five male wistar rats were randomly divided into normal group，model，low，medium and high puerarin-dose and effective medicine group，a total of 6 groups.Except the normal group，alcoholic hepatic fibrosis model was produced in rats by giving gavage with alcohol supplemented by corn oil，pyrazol.After 12 weeks，the status of hepatic fibrosis was observed by HE and Masson stain，The expression of PCNA，α-SMA in liver tissue was detected by immunehistochemical method.The proliferation index of liver cell was calculated by the expression of PCNA.［Results］The degree of liver fibrosis of the model group and each medication administration group were significantly higher than the normal group，and the degree of liver fibrosis of each medication administration group was lighter than the model group.But the degree of liver fibrosis of the low-dose group was more serious than any other medication administration group.The proliferation index in the model group was higher than any other groups，and the proliferation index in normal group was lower than the other groups.The expression of α-SMA in the model group was higher than any other.The expression of α-SMA in the medium puerarin-dose group，the high puerarin-dose group and the effective medicine group were lower than the model group.There was no significant difference between the expression of α-SMA in the low puerarin-dose group and the model group.［Conclusion］The efficacy of peurarin in the prevention and treatment of alcoholic hepatic fibrosis are implemented by inhibiting the proliferation and activation of hepatic stellate cell in rats，and the effects of the medium and the high dose group are more significant.

puerarin；alcoholic liver fibrosis；hepatic stellate cell（HSC）；proliferating cell nuclear antigen（PCNA）；Alpha-smooth muscle actin（α-SMA）

R285.5

A

1673-9043（2016）02-0132-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.16

天津中医药大学第四届大学生科技创新基金项目项目（CXJJ2013C05）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20121210120012）。

郝原青（1991-），女，2010级中医七年制本科在读学生。

苏金玲，E-mail：iamcloud@qq.com。

（2015-11-17）