电针百会、神庭穴对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠学习记忆功能及嘌呤受体P2X7表达的影响*

游小芳黄 佳△林晓敏宋长明林冰冰陶 静，2陈立典

（1.福建中医药大学康复医学院，福建 福州 350122；2.福建省康复技术重点实验室，福建 福州 350122；3.福建中医药大学，福建 福州 350122）

电针百会、神庭穴对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠学习记忆功能及嘌呤受体P2X7表达的影响*

游小芳1黄 佳1△林晓敏1宋长明1林冰冰1陶 静1，2陈立典3

（1.福建中医药大学康复医学院，福建 福州 350122；2.福建省康复技术重点实验室，福建 福州 350122；3.福建中医药大学，福建 福州 350122）

目的 观察电针百会、神庭穴对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠学习记忆功能及海马区嘌呤受体P2X7的影响，探讨其可能机制。方法 采用改良Zea Longa线栓法制备大鼠左侧大脑中动脉缺血（MCAO）再灌注损伤模型，造模成功后随机分为模型组与电针组，另设假手术组。电针组大鼠取穴百会、神庭，治疗7 d。采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆功能；采用免疫组化法观察大鼠海马区小胶质细胞活化标记物ED1与嘌呤受体P2X7的表达。结果 电针组大鼠空间学习记忆功能较模型组改善（P＜0.05），神经行为学评分降低（P＜0.05）。模型组大鼠海马区ED1、P2X7受体表达较假手术组明显增多（P＜0.01），电针组表达则少于模型组（P＜0.05）。结论 电针百会、神庭穴能改善局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠学习记忆功能，其机制可能与抑制小胶质细胞活化及P2X7受体表达有关。

脑缺血 电针 学习记忆功能 炎症 P2X7受体

脑卒中具有高发病率、高复发率、高致残率、高致死率的特征，是全球主要病死原因及长期残疾致病原因［1-2］。其中急性缺血性卒中发病率约占脑卒中80%［3］。认知功能障碍是脑卒中后常见功能障碍之一，其发病率高达65%［4-5］。针刺是治疗脑卒中常用方法之一，大量临床和基础研究均表明针刺能有效改善脑卒中后认知功能障碍，但其作用机制尚未完全清楚［6-9］。神经炎症反应在脑卒中后病理损伤过程起重要作用［10-13］。最近研究发现嘌呤/嘧啶类物质是最先激活胶质细胞炎症信号的主要分子［12］，其中嘌呤受体P2X7参与介导脑卒中后神经炎症反应，促进炎症介质释放，与认知功能损害密切相关［14-15］。课题组前期基础研究证实，针刺能抑制小胶质细胞（MG）活化，改善神经炎症反应，发挥脑保护作用［16-18］。本研究通过观察脑缺血再灌注损伤后海马区小胶质细胞ED1、嘌呤受体P2X7表达，探讨电针百会、神庭穴治疗缺血性脑卒中认知功能障碍的可能机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 采用成年健康雄性SPF级Sprague-Dawley大鼠，体质量（250±20）g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供［合格证号:SCXK（泸）2014-0003］。于福建中医药大学实验动物中心［许可证号: SYXK（闽）2014-0001］分笼饲养，每笼5只，自由进食及饮水，适应性喂养1周。实验过程均严格按照国际动物保护及使用指南规定进行。

1.2 试剂与仪器 P2RX7 Antibody（11144-1-AP，Proteintech）、Anti-ED1（AbDSEROTEC）、UIstraSentive SP（Mouse、Rabbit）IHC Kit（KIT-9720）、DAB显色试剂盒（DAB-0031）。光学显微镜（Leica，德国）、Image-lab图像分析系统（BIO-RAD LABORATORIES）、Morris水迷宫 （中国医学科学院药物研究所）、G6805型电针仪（华佗牌，苏州医疗用品厂有限公司）、0.5寸毫针（华佗牌30号，苏州医疗用品厂有限公司）。

1.3 模型制备与分组 所有实验大鼠术前12 h禁食，随机分组为假手术组12只与造模组24只，参照参考Zea Longa方法［19］制备大脑中动脉缺血（MCAO）模型。大鼠称质量后予10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，常规备皮、消毒。取颈正中切口切开皮肤约1.5 cm，钝性分离、充分暴露左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），用缝合线结扎CCA近心端、ECA，游离结扎ICA并用血管夹阻断其血流。在距离CCA结扎处远心端约3 mm处剪一小口，将栓线插入，撤去ICA上血管夹，沿ICA方向缓慢推动栓线至大脑中动脉分支处，感到轻微阻力时停止，线栓插入距离ECA、ICA分叉约18～20 mm，固定线栓，清洗创口，缝合皮肤。缺血90 min后回抽线栓至CCA分叉处，完成再灌注。假手术组只分离CCA、ECA、ICA，不予结扎和插线。术中及术后维持大鼠体温在37℃左右。动物苏醒后按Zea Longa评分判断模型是否成功。评分1～3分者纳入实验。造模成功动物随机分为模型组与电针组各12只。

1.4 干预措施 术后第2日，电针组穴位取百会、神庭，百会:顶骨正中，向后斜刺2 mm。神庭:前正中线上，在额顶骨缝交界线前方处，向上斜刺2 mm［20］，应用30号0.5寸华佗牌不锈钢毫针，G6805电针仪，电压峰值6 V，疏密波，频率2 Hz，电针20 min，每日1次，共7 d。假手术组、模型组回笼饲养，每日与电针组同样条件下抓取，不予电针治疗。

1.5 观察项目 1）Morris水迷宫测试:Morris水迷宫用来测试大鼠空间学习记忆功能［21］。Morris水迷宫的圆形水池直径为200 cm，高为50 cm，水深30 cm，水温保持（25±2）℃。水池分为4个象限，在第3象限中央放置平台，黑色圆心平台直径为6 cm，低于水面1～2 cm，四周的池壁表面光滑整洁，水池周围参照物从实验开始到结束位置保持不变。术后第3日开始训练。2）定位航行实验:实验开始前先将大鼠置于水池中，使其适应2 min，每日将大鼠按顺时针方向依次由第1、2、3、4象限入水点顺序，面向池壁放入水中。若大鼠在90 s内找到平台，并在平台上停留的时间达到3 s以上，认为大鼠找到平台，此时由计算机记录其时间为逃避潜伏期，让大鼠在平台上停留10 s；若大鼠在90 s内未找到平台，此时逃避潜伏期计为90 s，将大鼠牵引到平台上停留10 s，定位航行实验历时4 d。3）空间探索实验:术后第7日撤去平台，任意选取一入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录90 s内大鼠穿越放置原平台区域的次数。

1.6 免疫组化检测 采用腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠，经左心室先后灌注0.9%氯化钠注射液250 mL和4%多聚甲醛溶液250 mL，迅速断头取脑，放置于4%多聚甲醛内，4℃固定24～48 h。再行梯度脱水、石蜡包埋。切片，脱蜡，透明；置于枸橼酸缓冲液（pH=6.0）抗原修复15 min，3%H2O2室温孵育5 min；PBS漂洗3次，每次5 min；10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min；不同大脑切片上分别加入ED1一抗（1∶200）或者P2X7一抗（1∶300），放置湿盒中4℃过夜；滴加生物素标记二抗，室温孵育10 min，PBS漂洗3次；滴加链霉卵白素-过氧化物酶，室温10 min；PBS漂洗3次；DAB显色1 min；清水漂洗，苏木素复染细胞核1 min，返蓝20 min，脱水，透明，封片。400倍镜下观察。阳性表达呈棕黄色。左侧海马区随机取6个视野，分析每张图海马区平均光密度。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经行为学评分比较 见表1。缺血再灌注后2 h，模型组与电针组大鼠神经行为学评分较假手术组明显升高（P＜0.01），模型组和电针组间差异无统计学意义（P＞0.05）。电针治疗7 d后，电针组神经行为学评分较模型组降低（P＜0.05），提示电针对脑缺血再灌注大鼠的神经缺损症状有改善作用。

表1 各组大鼠神经行为学评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠神经行为学评分比较（分，±s）

与假手术组同时期比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组同时期比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组 别 n 缺血再灌注后2 h 电针治疗7 d假手术组 12 0 0模型组 12 2.31±0.48**1.85±0.6**电针组 12 2.15±0.69**1.23±0.44*△

2.2 各组大鼠水迷宫实验结果比较 见表2。定向航行实验结果显示，各组大鼠逃避潜伏期随着训练时间推移逐渐缩短。模型组逃避潜伏期较假手术组明显延长（P＜0.01）；电针组逃避潜伏期较模型组缩短（P＜0.05）。空间探索实验结果显示，模型组与电针组大鼠穿越平台次数明显少于假手术组（P＜0.05），电针组大鼠穿越平台次数明显多于模型组（P＜0.05），说明电针百会、神庭穴可以改善大鼠空间学习记忆能力。

表2 各组大鼠水迷宫实验结果比较（±s）

表2 各组大鼠水迷宫实验结果比较（±s）

大鼠穿过平台次数（次/90 s）组别 n第3日 第4日 第5日 第6日假手术组 7 34.44±13.87 24.91±8.21 11.01±3.04 10.48±4.69 3.86±1.22大鼠逃避潜伏期时间测试（s）模型组 780.71±6.84**78.04±8.36**67.93±26.09**73.45±17.35**1.29±1.11*电针组 761.46±16.28*40.69±16.81*△△30.23±13.13*△26.20±9.34*△△2.86±1.77*△

2.3 各组大鼠ED1免疫组织化学染色比较 见图1，表3。ED1标志活化的小胶质细胞。假手术组未观察到阳性细胞。模型组海马区可见大量小胶质细胞胞体增大，形态改变为圆形或阿米巴状。与假手术组相比，模型组与电针组阳性细胞明显增加（P＜0.01），电针组阳性细胞较模型组明显减少（P＜0.01）。提示脑缺血再灌注损伤后，海马区小胶质细胞活化，电针能有效抑制小胶质细胞活化。

图1 各组海马CA1区ED1的表达（免疫组织化学染色，400倍）

表3 各组ED1、P2X7平均光密度值 比较（±s）

表3 各组ED1、P2X7平均光密度值 比较（±s）

组 别 n ED1平均光密度值 P2X7平均光密度值假手术组 4 0 0.007±0.001模型组 4 0.051±0.001**0.077±0.014**电针组 4 0.032±0.003**△△0.061±0.011**△

2.4 各组大鼠P2X7免疫组织化学染色 见图2，表3。免疫组化P2X7阳性表达呈棕色或棕褐色。 结果显示，与假手术组相比，模型组与电针组P2X7阳性表达显著增加（P＜0.01），电针组阳性表达较模型组明显减少（P＜0.05）。提示脑缺血再灌注损伤后，海马区P2X7受体表达增多，电针能有效抑制P2X7受体表达。

图2 各组海马CA1区P2X7的表达（免疫组织化学染色，400倍）

3 讨 论

脑卒中认知功能障碍属中医学 “健忘”“呆证”“善忘”等范畴，病位在脑，病理性质为本虚标实，虚者为髓海不足，髓减脑消，神机失用。实者痰瘀内生，痹阻脑窍，神明失司。督脉循行入络脑，与脑髓关系密切，督脉的生理病理功能与认知功能障碍关系密切。督脉为“阳脉之海”，总督一身阳脉之气，而“阳气者，精则养神，柔则养筋”。督脉调畅，气血运行通畅，阳气得以宣发，精微得以布散，脑髓得以濡养，神机灵透，肢体活动自如。若督脉瘀阻，肾精匮乏，则神明失用。百会位于颠顶，是督脉、手少阳三焦经、足太阳膀胱经、足少阳胆经和足厥阴肝经的会穴；神庭为督脉、阳明经、足太阳交汇之穴。针刺百会、神庭穴常用于治疗心神病症，对脑卒中认知功能障碍疗效确切，临床应用广泛［6-7］。本研究显示，电针百会、神庭穴能改善缺血再灌注损伤大鼠空间学习记忆功能。

缺血性脑卒中后，小胶质细胞作为中枢神经系统固有的免疫效应细胞，迅速被激活，ED1是其活化的标志物，进而诱发神经炎症反应，促进炎症介质释放，如IL-1、IL-6、TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1、活性氧、基质金属蛋白酶等，导致血脑屏障破坏，促进循环中单核细胞浸润，中性粒细胞和淋巴细胞渗入，加重神经元损伤，抑制海马神经突触长时程增强（LTP），损害学习记忆功能。课题组前期研究表明电针可能通过抑制缺血周围区皮质小胶质细胞的活化及促炎因子的释放，起到神经保护作用［16］。

嘌呤/嘧啶类物质是最先激活胶质细胞炎症信号的主要分子［12］，P2X7是嘌呤受体之一，为离子通道受体，在中枢神经系统广泛表达，包括下丘脑核、丘脑、海马、皮质等，小胶质细胞上有表达。P2X7受体参与脑缺血后中枢神经系统炎症反应［14］。脑缺血损伤后，受损的神经元和其他神经胶质细胞迅速释放ATP，激活小胶质细胞上P2X7受体，胶质细胞上的P2X7受体通过与Parmexinl通道相互作用可以介导脑缺血缺氧损伤过程中ATP进一步释放、小胶质细胞的活化，活性氧的产生，促进产生和释放炎症介质，如IL-1β、TNF-α和IL-6，介导并放大炎症反应，促进神经元死亡，导致神经功能损伤加重［12］。P2X7受体特异性抑制剂通过抑制胶质细胞活化，减少炎症介质IL-1β、TNF-α、IL-6释放，减轻短暂性全脑缺血再灌注大鼠炎症反应，对海马区神经元有明显的保护作用，并可以改善全脑缺血后大鼠的空间记忆能力［14］。

本研究显示，大鼠脑缺血再灌注后，缺血周围区海马活化的小胶质细胞数量显著增加，P2X7受体表达增加；电针可抑制缺血周围区海马小胶质细胞活化、降低P2X7受体表达水平。综上，电针百会、神庭穴可改善脑缺血再灌注损伤大鼠空间学习记忆功能，其作用机制可能是通过抑制缺血周围区海马小胶质细胞的活化及P2X7受体表达。

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Effects of Electroacupuncture on Learning-memory Abilities and P2X7 Receptors Expressions in Hip-pocampus of Cerebral Ischemia-reperfusion Injury Rats

YOU Xiaofang，HUANG Jia，LIN Xiaomin，et al. College of Rehabilitation Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fujian，Fuzhou 350122，China.

Objective:To observe the efficacy of treatment with electroacupuncture at Baihui（DU20）and Shenting（DU24）on learning-memory ability and P2X7 receptors expressions in rats after cerebral ischemia/ reperfusion（I/R）injury and to explore its possible mechanism.Methods:The male SD rats were randomly divided into the ischemia control group and the electroacupuncture group after using a focal cerebral ischemia-reperfusion-injured rat model，and the sham operation group was established.The electroacupuncture group

electroacupuncture at Shenting（BL24）and Baihui（DU20）for 7 days.Learning and memory abilities were tested by Morris water maze；the expression of ED1 and P2X7 receptors was determined with immunohistochemical staining.Results:The learning and memory abilities were improved in the electroacupuncture group（P＜0.05），and the neurological deficit score decreased（P＜0.05），with less expression of ED1 positive microglia and P2X7 receptors（P＜0.05），compared with the model group.The expression of ED1 positive microglia and P2X7 receptors in the model group was obviously more than that of the sham operation group（P＜0.01）.Conclusion:The electroacupuncture at Shenting（DU24）and Baihui（DU 20）acupoints can improve the learning and memory ability from cerebral ischemia/reperfusion（I/R），which might be associated with inhibiting the microglia and P2X7 receptors activation in hippocampus.

Cerebral ischemia；Electroacupuncture；Learning and memory；Neuroinflammation；P2X7 receptors

R245.9+7

A

1004-745X（2016）10-1851-06

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.006

国家自然科学基金资助项目（81403462）；福建省教育厅资助省属高校项目（JK2014022）

△（电子邮箱：jasmine1874@163.com）

（2016-03-15）