大豆叶片黄酮类及多酚类物质对臭氧浓度升高的响应

田荣荣，王岩，王伟，毛兵，赵天宏

沈阳农业大学农学院，辽宁 沈阳 110161

大豆叶片黄酮类及多酚类物质对臭氧浓度升高的响应

田荣荣，王岩，王伟，毛兵，赵天宏*

沈阳农业大学农学院，辽宁 沈阳 110161

利用开顶式气室（Open Top Chamber，OTC），通过测定大豆叶片中黄酮类物质（总黄酮、芦丁、槲皮素和桑色素）和酚类物质（总多酚、阿魏酸和P-香豆酰）含量变化，以及苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）及脂肪氧化酶（LOX）3种酶活性变化，研究O3浓度升高对大豆叶片黄酮类和多酚类物质及其氧化酶的影响。以大气臭氧浓度为对照，设置110 nL·L-1O3浓度为一个处理，每个处理设3个OTCs重复。结果表明，随着大豆生育期的延长，与对照相比，总黄酮、芦丁、槲皮素和桑色素都表现出先上升后下降的趋势，在开花期达到峰值，且显著（P＜0.05）高于对照；P-香豆酰含量表现出先上升后下降的趋势，在开花期达到峰值，总多酚和阿魏酸都显著（P＜0.05）上升；PAL、PPO、LOX 3种酶的活性与对照相比都显著（P＜0.05）升高。O3浓度升高会诱导大豆叶片内PAL和PPO活性增强，进而增加叶片内黄酮类和多酚类物质的含量，提高大豆叶片抗氧化性，抵抗O3的伤害。但随着O3熏蒸时间的延长，大豆抗氧化性下降，导致籽粒产量下降。

大豆叶片；臭氧；多酚；黄酮；抗氧化性

TIAN Rongrong， WANG Yan， WANG Wei， MAO Bing， ZHAO Tianhong. Response of soybean leaves flavonoids and polyphenols to elevated ozone ［J］. Ecology and Environmental Sciences， 2016， 25（8）: 1277-1282.

对流层臭氧（O3）是由大气氮氧化物（NOx）、挥发性有机物（VOCs）和一氧化碳（CO）等经光化学反应生成的二次性污染物。有研究表明，在我国工业化发达地区，也就是京津冀地区和长江三角洲地区，超过10%的时间O3的平均小时浓度达到60 nL·L-1以上，京津地区、上海、福州最大O3浓度分别达到170、190、105 nL·L-1，沈阳8小时臭氧浓度超过75 nL·L-1（Yi et al.，2016；Wang et al.，2007；王宏等，2011；李夏等，2015）。O3的负效应与它的氧化性本质有关，O3通过气孔进入植物叶片，与细胞壁及细胞质成分快速反应生成活性氧物质，如H2O2、、·OH等，从而损伤植物细胞，导致光合速率下降、叶片早衰、叶片可见伤害、生产力下降以及生长减慢等（Heath，2009）。

O3胁迫下，植物形成一定的生物化学机制（例如改变抗氧化性、酶活性、代谢物浓度）以减弱活性氧对细胞的损害（Singh et al.，2010）。次生代谢物（酚类、萜类和含氮化合物）是生理代谢的物质基础，在植物对物理、化学环境的响应和反馈过程中有重要的生态学意义（陈晓亚等，1996）。多酚和黄酮类化合物是植物体内重要的酚类次生代谢物。Saviranta et al.（2010）研究表明，臭氧条件下红三叶草叶片内总酚类物质上升5%～12%。李丽等（2016）研究表明，O3处理下元宝枫的早生叶和晚生叶中总黄酮含量显著升高。黄酮类化合物槲皮素、芦丁、桑色素均可很好地清除超氧阴离子（）、羟自由基（·OH）和单线态氧（1O2），且有一定的量效关系。刘瑞等（2007）研究表明，槲皮素、芦丁可抑制Cu2+诱导的LDL的氧化修饰。阿魏酸和P-香豆酰是多酚类化合物，阿魏酸可以抑制诱导脂质过氧化作用，对质膜的结构和功能具有保护作用。梁红冬（2012）对阿魏酸的抗氧化性所进行的研究表明，阿魏酸对实用油脂有一定的抗氧化能力。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、脂肪氧化酶（LOX）是植物次生代谢过程中重要的酶，有利于提高植物抗氧化性。O3处理下的葡萄叶片细胞系的PAL活性增加（Sgarbi et al.，2003）。赵天宏等（2011）研究表明在80 nL·L-1O3浓度下，大豆PAL、PPO、LOX活性显著（P＜0.05）升高。目前国内，对槲皮素、芦丁等上述几种酚类物质在O3浓度升高下的响应机制，以及总黄酮和多酚类物质与PAL、PPO、LOX这3种氧化酶活性之间的关系研究较少，有待进一步深入研究。

O3胁迫下会导致农作物产量下降。大豆是世界重要经济作物之一，也是高O3敏感性作物之一，在O3浓度低于40 nL·L-1时就会导致大豆产量下降（Ashmore et al.，2006）。本试验以大豆（Glycine max）叶片为主要研究对象，以植物次生代谢物质为出发点，利用开顶式气室探讨近地层O3浓度升高对大豆叶片黄酮类和多酚类物质及其抗氧化性的影响，以揭示大豆叶片中次生代谢物质对O3浓度升高的适应机制与响应方式。

1　材料与方法

1.1试验设计

以大豆栽培品种“铁丰29”为试验材料，该品种生育期为130～133 d，适合在中等或中等以上肥力的土壤种植。在沈阳农田生态系统国家野外科学观测研究站内进行，利用开顶式气室（Open Top Chamber，简称OTC）对大豆进行熏蒸试验。主要设备包括6个结构完全相同的OTCs气室（横截面为正八边形，边长为1.15 m，高为2.4 m，玻璃室壁）以及与OTCs气室相配套的通气、通风控制设备。其中又包括用于产生O3的O3发生器（BGY-Q8，北理国科，中国）、监控开顶箱内O3浓度的O3传感器（S-900，艾尔科，新西兰）、采集开顶箱内温湿度数据的温湿度传感器以及数据分析与自动控制充气系统。在整个试验期间，气室内实际气体浓度控制稳定。

本试验共设2个处理，即CK处理：OTC中的对照，O3浓度为环境浓度；O3处理：O3浓度升高，为（110±10）nL·L-1。每个处理（OTC）设置3次重复。5月10日播种，出苗20 d后开始进行熏蒸试验，每天熏蒸9 h（8:00—17:00），试验期间水分、肥料均匀一致，无病虫害及杂草等限制因素。分别于大豆分枝期（6月30日）、开花期（7月24日）和结荚期（8月12日）取样，在9月7日停止熏蒸直至大豆成熟，在每个生育时期分别选择大豆相同叶片部位测定相关的生理生化指标，气室内3次重复。

1.2测定项目与方法

1.2.1黄酮类物质含量的测定

总黄酮采用NaNO2-A1（NO3）3分光光度法测定（魏循等，2003）；芦丁、槲皮素、桑色素含量采用高效液相色谱法（高效液相色谱仪，1100LC，美国Agilent公司）测定，标样为Sigma（美国）公司产品。

1.2.2多酚类物质含量的测定

总多酚采用酒石酸铁法（孔祥生等，2008）；以没食子酸丙酯（Sigma，美国）为标准品绘制标准曲线。阿魏酸和P-香豆酰含量采用高效液相色谱法（高效液相色谱仪，1100LC）测定，标样为Sigma（美国）公司产品。

1.2.3酶活性的测定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活性的测定采用巯基乙醇法（李晓辉等，2008）；脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性采用亚油酸钠法测定（孔祥生等，2008）；多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性测定采用邻苯二酚法测定（孔祥生等，2008）。

1.2.4大豆产量的测定

植株收获后，每个处理分别选取大豆15株，籽粒自然风干，测定籽粒的百粒重、单株粒重及单株粒数等大豆籽粒产量的相关指标，用电子分析天平（感量0.001）称重。

1.3数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件处理数据，文中数据均为各处理的平均数±标准偏差。采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析（One-wayANOVA），用最小显著差异法（LSD）进行显著性分析。

2　结果与分析

2.1臭氧浓度升高对大豆叶片黄酮类化合物的影响

如图1所示，O3胁迫下，大豆叶片内的黄酮类化合物都表现出先上升后下降的趋势，且各项指标与对照相比都是先下降后上升。

2.1.1臭氧浓度升高对大豆叶片总黄酮含量的影响

如图1（a）所示，随着大豆生育时期的延长，大豆叶片内的总黄酮含量呈现先上升后下降的变化趋势，总黄酮的含量在开花期达到最高值。与CK相比，O3处理下大豆叶片总黄酮含量在分枝期降低11.68%，在开花期和结荚期分别升高16.85%和7.68%，并且在各个生育时期均达到显著（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01）。

2.1.2臭氧浓度升高对大豆叶片芦丁、槲皮素、桑色素含量的影响

如图1（b）所示，随着大豆生育时期的延长，大豆叶片内的芦丁含量呈现先上升后下降的变化趋势，芦丁的含量在开花期达到最高值。与CK相比，O3处理下大豆叶片芦丁含量在分枝期降低13.48%，在开花期和结荚期分别升高4.03%和19.27%，并且在分枝期和结荚期达到极显著差异（P＜0.01），但在开花期差异不显著（P＞0.05）。

从图1（c）可以看出，随着大豆生育时期的延长，大豆叶片内的槲皮素含量呈先上升后下降趋势，在开花期含量达到最高值。与CK相比，O3处理下大豆叶片槲皮素含量在分枝期降低25.08%，在开花期和结荚期分别升高16.85%和7.68%，并且在各个时期均达到显著（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01）。

如图1（d）所示，随着大豆生育时期的延长，大豆叶片内的桑色素含量先上升后下降，在开花期桑色素的含量达到最高值。与CK相比，O3处理下大豆叶片桑色素含量在分枝期降低23.63%，在开花期和结荚期分别升高16.85%和17.81%，并且在各个时期均达到显著（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01）。

图1　O3胁迫下大豆叶片总黄酮（a）、芦丁（b）、槲皮素（c）、桑色素（d）含量的变化Fig. 1　Change of flavonoids， rutin， quercetin， morin content in soybean leaves under O3stress

图2　O3胁迫下大豆叶片总多酚（a）、阿魏酸（b）、P-香豆酰（c）含量的变化Fig. 2　Change of total polyphenols （a）， ferulic acid （b）， P-coumaric acid （c） content in soybean leaves under O3stress

2.2臭氧浓度升高对大豆叶片多酚类化合物的影响

2.2.1臭氧浓度升高对大豆叶片总多酚含量的影响

由图2（a）可知，随着大豆生育时期的延长，大豆叶片总多酚含量呈上升趋势。与CK相比，O3处理下大豆叶片总多酚含量升高22.14%～39.41%，并且各个胁迫均使大豆叶片在各个生育时期均达到差异显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）水平，说明在110 nL·L-1O3胁迫下大豆叶片多酚类化合物含量增加。

2.2.2臭氧浓度升高对大豆叶片阿魏酸、P-香豆酰含量的影响

由图2（b）可知，随着大豆生育时期的延长，大豆叶片阿魏酸含量呈上升趋势。与CK相比，O3处理条件下阿魏酸含量升高17.22%～72.78%，并且在开花期达到显著差异水平（P＜0.05），在分枝期和结荚期达到极显著差异水平（P＜0.01）。说明在110 nL·L-1O3胁迫下大豆叶片阿魏酸含量增加。

由2（c）可知，随着大豆生育时期的延长，对照处理下大豆叶片P-香豆酰呈上升趋势，在O3胁迫下大豆叶片P-香豆酰含量呈先上升后下降趋势，在开花期含量达到最高值。O3处理条件下大豆叶片P-香豆酰含量升高9.72%～33.97%，并且在各个时期均达到显著（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01）。

2.3臭氧浓度升高对大豆叶片PAL、PPO、LOX活性的影响

由图3（a）可知，随着大豆生育时期的延长，大豆叶片中苯丙氨酸解氨酶的活性呈现上升趋势。与CK相比，O3处理下大豆叶片苯丙氨酸解氨酶活性的增幅为0.13%～15.01%，并且在结荚期达到显著（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01），但在分枝期和开花期差异不显著（P＞0.05）。

由图3（b）可知，随着大豆生育时期的延长，大豆叶片内的多酚氧化酶的活性呈现上升趋势。与CK相比，O3处理条件下多酚氧化酶活性的增幅为2.78%～6.14%，并在结荚期达到显著（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01），但在分枝期和开花期差异不显著（P＞0.05）。

由图3（c）可知，随着大豆生育时期的延长，大豆叶片脂氧合酶活性呈上升趋势。与CK相比，O3处理下大豆叶片脂氧合酶活性的增幅为20.10%～39.35%，并且在各个生育时期均达到显著（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01）。说明O3胁迫下大豆叶片LOX活性增加。

2.4臭氧浓度升高对大豆籽粒产量的影响

由表1可知，与CK相比，O3胁迫处理条件下大豆的单株粒数、单株粒重、百粒重和单株荚数分别减少38.28%、53.33%、40.63%和37.17%，并且单株粒数、单株粒重、百粒重和单株荚数与对照相比均达到极显著差异（P＜0.01）。

图3　O3胁迫下大豆叶片PAL（a）、PPO（b）、LOX（c）活性的变化Fig. 3　Change of PAL （a）， PPO （b）， LOX （c） activity in soybean leaves under O3stress

表1　O3胁迫对大豆籽粒产量的影响Table 1　Effects of O3stress on grain yield of soybean

3　讨论

3.1臭氧浓度升高对大豆叶片次生代谢物的影响

多酚和黄酮类化合物中的邻位酚羟基易被氧化成醌类结构，另外对活性氧等自由基具有很强的捕捉能力，所以多酚和黄酮类化合物具有较强的抗氧化性和清除自由基能力，对O3胁迫有显著的解毒作用，并且抗氧化活性的强弱与其含量的高低有较强的相关性（Fernandes et al.，2016；吴时敏等，2002；黄琴等，2014）。槲皮素、芦丁和桑色素是植物体内的几类黄酮类化合物，具有一定的抗氧化性。O3胁迫下植物体内会迅速产生大量自由基，自由基与植物体内核蛋白、脂肪酸等物质结合生成氧化物或过氧化物，使细胞功能衰退。黄酮类化合物会阻止自由基在植物机体内产生，通过与反应阻止自由基生成，并且与金属离子（如Fe2+）螯合抑制·OH产生，还能作用于与自由基有关的酶，间接减少自由基的产生（延玺等，2008）。O3胁迫初期自由基大量产生会加速植物体内黄酮类化合物的消耗，故O3胁迫初期大豆叶片内的黄酮类化合物含量低于对照，这与赵天宏等（2011）的试验结果一致，但随着O3熏蒸时间的延长，黄酮类物质合成受阻，含量下降。

O3的强氧化能力会引起植物体内酚类化合物含量的变化（Moura et al.，2014）。由图2可知随着大豆生育期的延长，O3胁迫下总多酚和阿魏酸含量显著上升。近代生物化学认为酚类物质对植物生长的抑制作用是由于吲哚乙酸氧化酶的活化，而一元酚是活化该酶的辅基之一。一元酚活化植物体内的吲哚乙酸氧化酶，从而将吲哚乙酸（植物生长素）氧化成不活泼的3-亚甲氧基代吲哚，不利于植物生长；但二元酚或多元酚会抑制这种酶的活性，进而促进植物生长（何光训，1992）。阿魏酸属于一元酚，随着O3熏蒸时间的增加，阿魏酸的含量显著增加，说明O3熏蒸造成阿魏酸在大豆体内积累，进而影响植株生长。与对照相比，臭氧处理下大豆总多酚含量显著增加，大豆通过增加多酚类物质来提高抵抗能力，减弱O3伤害。

O3胁迫下，黄酮类化合物含量在开花期达到峰值，而多酚类化合物含量一直呈上升趋势，说明在O3胁迫前期黄酮类化合物和多酚类物质共同起作用，而胁迫后期多酚类化合物起主要作用。

3.2臭氧浓度升高下大豆叶片酚类物质和氧化酶的关系

酚类化合物合成于苯丙烷次生代谢途径，PAL是苯丙氨酸代谢途径中的限速酶和中心酶，L-苯丙氨酸经PAL作用生成反式肉桂酸，进入苯丙烷类代谢途径，生成香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物，这些产物可进一步转化为香豆素、绿原酸，也可形成CoA酯，并进一步转化为类黄酮、木质素、生物碱等（张宽朝等，2008）。因此，PAL活性可以间接反应多酚类和黄酮类化合物的含量变化。大豆叶片中PAL活性与总多酚和总黄酮含量呈正相关（赵天宏，2011）。同时PAL是一种诱导酶，O3胁迫会诱导PAL基因表达，PAL活性增加，促进多酚类和黄酮类物质的合成，从而增加大豆叶片对O3胁迫的抗氧化能力。在本试验中，随着O3熏蒸的时间延长，即使PAL活性增加，但由于O3的伤害作用太大，结荚期黄酮类化合物含量表现出下降趋势；多酚类化合物含量与PAL活性都呈现出上升趋势。可见，PAL对植物抗逆性的增加有显著作用。

PPO活性大小与植物的代谢强度及环境胁迫密切相关，已有大量的研究表明，当植物受到伤害、病害和虫害时PPO活性增加（雷东锋等，2004），本试验也证实了这一点，随着O3胁迫时间的延长PPO活性明显上升。PPO是以多酚类物质为底物的酶，将多酚类物质氧化成醌类物质，形成咖啡酸、绿原酸等抗病物质，其速率受酶促反应的限制，如果酚类物质增加，则反应底物浓度增加，从而PPO活性增加（何光训，1992）。本试验中，O3浓度升高条件下PPO与多酚类物质的变化趋势一致，说明PPO与多酚类物质可能存在正相关关系。

大豆叶片中，脂肪氧化酶（LOX）与反应底物是分开的，当植株受到伤害或产生组织损伤，LOX才会与底物产生接触（左进华等，2007）。O3胁迫下脂肪氧化酶通过脂肪氧化酶途径（LOX途径）加快植物脂肪酸氧化，生成大量过氧化物，使叶绿体光化学反应失活并破坏细胞膜的结构，增加膜透性，促进植物衰老（扎桑等，2015）。另外，LOX途径经过一系列反应生成植物内源激素茉莉酸，茉莉酸会促进乙烯合成、叶片衰老、叶片脱落、气孔关闭、呼吸作用（扎桑等，2015；Gigot et al.，2010）。本试验中，LOX活性受O3诱导显著增加，表明O3胁迫导致大豆叶片内氧化作用加剧。

3.3臭氧浓度升高对大豆籽粒产量的影响

本试验中，O3浓度升高条件下大豆籽粒产量显著下降。O3对大豆的开花期有显著影响，O3胁迫下大豆的开花数量减少，且影响花期的受精过程，导致结荚期大豆荚数明显低于CK，大豆籽粒减少，使得籽粒产量降低（Sun et al.，2014；金东艳等，2009）。

4　结论

O3浓度升高增强了大豆叶片内PAL和PPO活性，增加了叶片内黄酮类和多酚类物质的含量，提高了大豆叶片抗氧化性，从而达到抵抗O3伤害的目的。同时，LOX活性升高，增加了膜透性，加剧了对大豆叶片所产生的伤害作用。随着O3熏蒸时间的延长，大豆抗氧化性下降，植株受到损伤，籽粒产量下降。

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Response of Soybean Leaves Flavonoids and Polyphenols to Elevated Ozone

TIAN Rongrong， WANG Yan， WANG Wei， MAO Bing， ZHAO Tianhong*
College of Agronomy， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110161， China

This paper mainly studies the effects of ozone on secondary metabolites and enzymes in soybean （Glycine max） leaves. Utilizing the open top chamber （OTC）， we have investigated variations of soybean leaves under O3fumigation in the following aspects: flavonoids （rutin， quercetin， morin） and polyphenols（ ferulic acid， p-coumaric acid）， and the activities of phenylalanine ammonia-lyase （PAL）， polyphenol oxidase （PPO） and lipoxygenase （LOX）. Meanwhile with the atmospheric ozone concentration as the control， the 110 nL·L-1O3concentration was set as treatment， each of which was provided with three OTCs repeats， and each OTC with three repeats. The results demonstrated that in the whole growth period of treated soybean， compared with CK， the contents of total flavonoids， rutin， quercetin， morin first increased and then decreased， in the flowering period reaching the peaks，which showed significantly （P＜0.05） higher than those of the control； p-coumaric acid content alsofirst increased and then decreased， during the flowering period reaching its peak； total polyphenols and ferulic acid experienced significant increase （P＜0.05）；and compared with the CK， the activities of three enzymes of PAL， PPO and LOX increased significantly （P＜0.05）， too. Elevated O3induced enhancement of soybean leaf PAL and PPO activities， increasing leaf flavonoids and polyphenols contents ，which further improved the antioxidant of soybean leaves and resistance to O3damage. However， with the extension of O3fumigation， the decline of soybean antioxidant activity would result in the decrease of grain yield.

soybean leaves； ozone； polyphenols； flavonoids； oxidation resistance

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.08.004

Q945.79； X17

A

1674-5906（2016）08-1277-06

国家自然科学基金项目（31570404；30970448）

田荣荣（1992年生），女，硕士研究生，研究方向为植物生理生态学。E-mail: 224046075@qq.com

∗赵天宏（1972年生），男，教授，博士，研究方向为全球气候变化和植物生理生态。E-mail: zth1999@163.com

2016-05-26

引用格式：田荣荣， 王岩， 王伟， 毛兵， 赵天宏. 大豆叶片黄酮类及多酚类物质对臭氧浓度升高的响应［J］. 生态环境学报，2016， 25（8）: 1277-1282.