大孔吸附树脂纯化常春藤皂苷C工艺研究

曾建刚， 孙化鹏， 阮琴妹， 张 珉， 钟晓红

(1.汉寿县林业局， 湖南 汉寿 415900； 2.湖南农业大学， 湖南 长沙 410128； 3.湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004)

大孔吸附树脂纯化常春藤皂苷C工艺研究

曾建刚1， 孙化鹏2， 阮琴妹2， 张 珉3， 钟晓红2

(1.汉寿县林业局， 湖南 汉寿 415900； 2.湖南农业大学， 湖南 长沙 410128； 3.湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004)

通过静态吸附试验比较7种树脂对常春藤皂苷C的吸附与解吸，筛选出效果最佳树脂，通过动态吸附试验对最佳树脂的上样pH、上样体积、洗脱液浓度、洗脱体积、洗脱流速进行优化。结果表明：HPD-100树脂对常春藤皂苷C的吸附与解吸性能最好，HPD-100树脂对常春藤皂苷C纯化的最佳条件为：上样体积为6 BV，洗脱液乙醇浓度为80%，洗脱体积为7 BV，洗脱流速为1 BV/h。

常春藤皂苷C； 吸附； 洗脱； 大孔吸附树脂

洋常春藤(Hederahelix)为五加科常春藤属的多年生常绿攀援藤本植物，全株均可入药[1]。研究表明其主要功能成分是三萜皂苷类化合物[2]，其中常春藤皂苷C在洋常春藤中含量最高，欧洲药典和英国药典收录洋常春藤作为植物药也是以洋常春藤叶片中常春藤皂苷C含量高于3%为主要含量指标[3]。目前很多欧洲制药企业生产的常春藤成药剂型都是以常春藤皂苷C为含量指标的提取物作为原料，而我国作为植物提取物的主要出口国，生产常春藤皂苷C提取物并进入欧洲市场有着良好的发展前景。大孔吸附树脂具有吸附量大、机械强度高、速度快、选择性好、易解吸附、可再生处理等优点，其在中草药成分的分离纯化中越来越普及[4-8]。研究表明，利用大孔吸附树脂来纯化皂苷类化合物可达到较好的效果[9-12]。我们在上述研究的基础上探讨大孔吸附树脂对常春藤皂苷C的纯化工艺，旨在筛选出效果最佳的树脂，并对最佳树脂的上样、洗脱条件进行优化，为进一步的实验研究及常春藤皂苷C标准化提取物的工业化生产提供参考依据。

1 材料、仪器与试剂

1.1材料

洋常春藤鲜叶于2014年8月采自湖南省长沙市，洗净后置于鼓风干燥箱中60 ℃烘干至恒质量，粉碎后过60目筛，密封保存备用。

1.2仪器与试剂

Shimadzu高效液相色谱仪，包括Shimadzu SPD20A检测器、Shimadzu SIL20A自动进样器、Shimadzu LCSolutions工作站；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；KQ-5200DB数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；THZ-92B恒温摇床(上海浦东物理仪器厂)；循环水多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；DR-1001旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)。

HPD-750型、D101型、HPD-100型、AB-8型、NKA-9型、ADS-17型、DM-130型树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，无水乙醇为分析纯，乙腈、磷酸为色谱纯，蒸馏水(自制)。常春藤皂苷C标准品(≥98%，南京春秋生物工程有限公司)。

2 试验方法

2.1HPLC测定常春藤皂苷C含量

2.1.1 HPLC色谱条件 色谱柱：Unitary C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)。二元高压梯度洗脱：0～35 min，20%～50%A；35～40 min，50%～60%A。检测波长210 nm，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，柱温25 ℃。

2.1.2 标准品溶液的制备 精密称取常春藤皂苷C标准品5.1 mg，甲醇溶解定容至5 mL，配成浓度为1.02 mg/mL的储备液。

2.1.3 标准曲线的制作 分别将标准品溶液用甲醇稀释1、2、3、4、5倍，摇匀，按2.1.1项色谱条件进样检测。以标准品常春藤皂苷C的浓度(mg/mL)为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2.1.4 常春藤皂苷C含量测定 将样品溶液按2.1.1项的色谱条件测定峰面积，根据标准曲线线性方程计算得出常春藤皂苷C的含量，从而计算常春藤皂苷C得率。

2.2树脂的预处理

选取HPD-750、D101、HPD-100、AB-8、NKA-9、ADS-17、DM-130七种型号的树脂进行试验，各树脂用无水乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀后，用蒸馏水反复清洗至流出液无浑浊且无醇味，其次用2%HCl溶液浸泡2 h，用蒸馏水冲洗至中性，再用5%NaOH溶液浸泡2 h，用蒸馏水冲洗至中性，将树脂储藏备用。

2.3常春藤皂苷C粗提液的制备

取200 g洋常春藤粉末按照文献记载[13]的最佳提取工艺条件进行提取，即乙醇浓度69.4%，提取时间43.5 min，料液比35∶1，超声提取2次，过滤且合并滤液，减压浓缩至一定体积，得常春藤皂苷提取溶液，密封保存，备用。

2.4不同型号大孔树脂的筛选

将预处理好的7种大孔树脂去除表面水分，待干燥后，各精密称取2 g置于100 mL锥形瓶中，分别加入30 mL已知浓度的常春藤皂苷C提取液，在20 ℃摇床中振荡吸附24 h，将吸附饱和的树脂过滤，按照2.1中的HPLC法测定滤液中常春藤皂苷C的含量，并按下面公式计算出树脂对常春藤皂苷C的吸附率。然后取上述各吸附饱和的树脂，用30 mL体积分数为95%乙醇在摇床中解吸24 h，取出并测定解吸液中常春藤皂苷C的含量，分别按下面公式计算各树脂的解吸率。比较各种型号树脂对常春藤皂苷C的吸附量和解吸率，筛选解吸最佳树脂。重复平行3次试验，取平均值。

吸附量=(C0-C1)V1/W

(1)

吸附率=(C0-C1)/C0×100%

(2)

解吸率=C2V2/(C0-C1)V1×100%

(3)

式中：C0为吸附液初始浓度(mg/mL)；C1为吸附后样液中剩余的浓度(mg/mL)；C2为洗脱液的质量浓度(mg/mL)；V1为吸附液体积(mL)；V2为洗脱液体积(mL)；W为大孔吸附树脂质量(g)。

2.5pH值对吸附率的影响

精密称取由静态吸附试验筛选出的最佳树脂2 g，分别置于100 mL锥形瓶中，加入30 mL已知浓度的常春藤皂苷C提取液，用HCl和NaOH调节提取液pH值为2、4、6、8、10、12。在20 ℃摇床中振荡吸附24 h，使树脂吸附饱和，将提取液过滤，并分别计算出各pH的常春藤皂苷C吸附率，重复平行3次试验，取平均值。

2.6泄露曲线确定上样体积

取预处理好的大孔树脂进行湿法装柱，层析柱口径为1 cm，柱体积为20 mL，用已知浓度的常春藤皂苷提取液以1 BV/h的流速进行上样，每3 mL收集一管流出液，并检测流出液中常春藤皂苷C的浓度，以吸附液体积为横坐标，吸附液中常春藤皂苷C的浓度为纵坐标，绘制泄露曲线，从而确定适合的上样体积。重复平行3次试验，取平均值。

2.7乙醇浓度对解吸率的影响

取预处理好的大孔树脂湿法装柱，层析柱口径为1 cm，柱体积为20 mL，取120 mL已知浓度的常春藤皂苷C提取液以1 BV/h的流速进行上样，上样完成后用2 BV的蒸馏水初步洗脱，去除水溶性色素、无机盐及多糖等水溶性杂质，再用5 BV蒸馏水或浓度为30%、45%、60%、75%、90%的乙醇以1 BV/h的流速进行洗脱，计算洗脱液中常春藤皂苷C的解吸率。用移液管吸取10 mL洗脱液置于已称质量的蒸发皿中用水浴锅蒸干，放入105 ℃烘箱中，烘2 h取出，移入干燥器中冷却至室温后称质量，再次放入烘箱1 h，直到两次质量之差小于2 mg，通过蒸发皿质量之差可得洗脱液的干物量，由常春藤皂苷C的含量与干物量可计算出洗脱液中常春藤皂苷C的纯度。常春藤皂苷C回收率和纯度较高的即为最佳洗脱浓度。重复平行3次试验，取平均值。

2.8洗脱体积对解吸率的影响

取预处理好的HPD-100树脂进行湿法装柱，层析柱口径为1 cm，柱体积为20 mL，用6 BV已知浓度的常春藤皂苷C提取液以1 BV/h的流速上样，上样完成后用2 BV的蒸馏水初步洗脱，去除水溶性色素、无机盐及多糖等水溶性杂质，再用1 BV、2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV最佳浓度的洗脱液进行洗脱，洗脱流速为1 BV/h，计算洗脱液中常春藤皂苷C的解吸率。重复平行3次试验，取平均值。

2.9洗脱流速对解吸率的影响

取预处理好的树脂进行湿法装柱，层析柱口径为1 cm，柱体积为20 mL，用6 BV已知浓度的常春藤皂苷C提取液以1 BV/h的流速上样，上样完成后用2 BV的蒸馏水初步洗脱，取5 BV浓度为75%的乙醇以1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h的流速进行洗脱，计算洗脱液中常春藤皂苷C的回收率与纯度。重复平行3次试验，取平均值。

2.10洗脱条件的正交试验

在单因素试验结果的基础上，选取洗脱浓度、洗脱体积、洗脱流速三个影响解吸率及常春藤皂苷C纯度的因素，设计L9(34)正交表，通过回收率和纯度综合考察确定最佳洗脱条件，并对最佳洗脱工艺进行验证试验。

表1 正交试验因素水平表Tab 1 Thefactorsandlevelsoforthogonalexperiment水平因素A浓度(%)B体积(BV)C流速(BV/h)160512706238073

3 结果与分析

3.1常春藤皂苷C的HPLC检测方法的确定

通过不断调整流动相比例，在2.1.1项二元高压梯度洗脱时，样品溶液色谱图基线平稳，目标组分常春藤皂苷C峰型对称且与其他物质峰分离度好，详见图1。

按2.1.3项试验方法得出常春藤皂苷C标准曲线线性方程为：Y=1.7×106X-7 972.3，R2=0.999 3。该结果表明，常春藤皂苷C的浓度与峰面积线性关系良好，常春藤皂苷C检出范围为0.06～1.02 mg/mL，HPLC测定常春藤皂苷C含量的试验方法有效可行。

3.2大孔树脂的筛选

图1 对照品与样品的HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of the standard and the sample

由于各树脂的极性、孔径、比表面积、孔容等理化性质的不同，导致树脂对不同化合物的纯化效果也大不相同。评价大孔树脂的性能要从静态吸附率和解吸率两方面综合考察，不但要吸附率高，而且解吸率也要高，才能保证有效成分的充分利用及回收[14]。按照2.4项的方法测定七种大孔吸附树脂的静态吸附率与解吸率，结果如表2所示。

表2 7种型号树脂对常春藤皂苷C的吸附率和解吸率Tab 2 ComparisonofadsorptionanddesorptioncapabilityofseventypesofmacroporousresinonhederacosideC树脂型号极性吸附率(%)解吸率(%)HPD-750中极性70 197 3D-101非极性17 779 4HPD-100非极性81 996 7AB-8弱极性78 590 8NKA-9极性48 589 5ADS-17中极性9 592 1DM-130弱极性61 587 4

由表2可以看出，七种大孔吸附树脂对常春藤皂苷C的吸附和解吸有着较大的差异，其中HPD-100及AB-8两种型号的树脂对常春藤皂苷C的吸附效果较好，吸附率较高。从理化性质上看，除D-101外其它非极性或弱极性树脂的吸附效果要好于极性或中极性树脂，说明非极性或弱极性树脂能更好地吸附常春藤皂苷C。实验结果表明，HPD-100型树脂吸附率最高，与理论相符。同样，解吸效果也与树脂理化性质相关，一般比表面积较大的树脂容易被洗脱，由实验数据可知，七种树脂的解吸率均较高，其中HPD-750和HPD-100都达到了96%以上，但HPD-750吸附率较低，综合确定HPD-100树脂为纯化常春藤皂苷C的最佳树脂。

3.3pH值对吸附率的影响

不同pH上样液对常春藤皂苷C吸附率的影响结果如图2所示，可以看出，上样液的pH值对HPD-100树脂纯化常春藤皂苷C的影响不大，吸附率均在84%左右，经统计分析无显著差异，试验结果的微小差距也可能是操作误差引起的。因此下面试验均采用上样液本身的pH条件进行。

图2 上样液pH值对吸附率的影响Fig.2 Effects of pH values of sample solution on adsorption

3.4泄露曲线确定上样体积

通过绘制泄露曲线，可以充分利用和保留目标成分，确定上样终点，提高生产效率。一般认为，当泄露流出的吸附液浓度达到上样液浓度的1/10时为泄露点，即上样终点[15]。通过2.1项的HPLC法检测出上样液中常春藤皂苷C的浓度为1.72 mg/mL。HPD-100对常春藤皂苷C的泄露曲线见图3，当吸附液流出90 mL时，高效液相色谱检测出常春藤皂苷C开始有泄露，到流出120 mL时，检测出泄露液中常春藤皂苷C浓度为0.18 mg/mL，浓度为上样液的十分之一，将其确定为最佳上样体积。后续流出的吸附液到150 mL时泄漏量趋于平缓。为了尽可能保留有效成分，最佳上样体积为120 mL(6 BV)。

图3 泄露曲线Fig.3 Leakage curve

3.5洗脱液浓度对解吸率的影响

洗脱液浓度对洗脱效果有较大的影响。作为对照，先用水作为洗脱液进行洗脱，结果发现，解吸率几乎为零，由此可认为常春藤皂苷C不能用水洗脱。由图4可知，随着乙醇浓度的增加，解吸率逐渐升高，乙醇浓度大于60%后，解吸率增长平缓。可选择60%～90%乙醇浓度进行洗脱，洗脱效果较优。

为了达到更好的纯化效果，除了考察乙醇浓度对解吸率的影响，还应考虑常春藤皂苷C占干物质量的纯度。洗脱液中常春藤皂苷C含量占上样液常春藤皂苷C含量的百分比为回收率，能更直观地体现纯化效果。乙醇浓度对常春藤皂苷C回收率及纯度的影响见表3，由表3可知，浓度为75%和90%的乙醇对常春藤皂苷C的回收率较高，但90%浓度的乙醇洗脱纯度较低，综合考虑确定洗脱常春藤皂苷C的最佳乙醇浓度为75%。

3.6洗脱体积对解吸率的影响

洗脱剂用量越大，解吸率越高，但为了尽可能地减少试剂用量，节约成本，必须考察洗脱液体积对解吸率的影响。由图5可知，随着洗脱液体积倍数的增加，解吸率逐渐升高，当洗脱液达到5 BV时，基本洗脱完全，解吸率高达96.8%，趋于平衡。因此，选择5 BV作为最佳洗脱体积。

图4 乙醇浓度对解吸率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption rate

表3 不同乙醇浓度对回收率及纯度的影响Tab 3 Therecoveryrateandpuritywithdifferentethanolconcentration乙醇浓度(%)回收率(%)干物量(mg)纯度(%)3023 511151 94548 823052 26075 740246 37580 542246 99081 654936 5

3.7洗脱流速对解吸率的影响

一般认为，洗脱流速越慢，洗脱越完全，但工业生产中需要节约生产时间，提高设备效率，因此需考察洗脱流速对解吸率的影响。由图6可知，解吸率随着洗脱流速的增加逐渐降低，1 BV/h和2 BV/h的流速解吸率均较高，在96%以上，洗脱效果较佳。而3 BV/h和4 BV/h洗脱效果稍差，其解吸率在92%以上。

图5 乙醇用量对解吸率的影响Fig.5 Effects of ethanol volumes on desorption rate

图6 乙醇流速对解吸率的影响Fig.6 Effects of ethanol flow velocities on desorption rate

同样为了达到更好的纯化效果，除了考察洗脱流速对解吸率的影响，还应考虑常春藤皂苷C占干物质量的纯度。由表4可知，洗脱流速在1～3 BV/h时，常春藤皂苷C的回收率及纯度都较高，纯化效果较佳，工业生产中为了提高效率，可采用3 BV/h的流速进行洗脱。试验室为了达到最优的纯化效果，可选用1 BV/h的流速进行洗脱。

表4 不同洗脱流速对回收率及纯度的影响Tab 4 Therecoveryrateandpuritywithdifferentelutionvelocity洗脱流速(BV/h)回收率(%)干物量(mg)纯度(%)181 830042 7280 729842 4380 029442 6478 831339 4

3.8正交试验结果分析

根据单因素试验结果，设计正交试验。试验结果见表5，由表中极差(R)可知，各因素对洗脱效果的影响顺序为A>C>B，即乙醇浓度>洗脱流速>洗脱体积。方差分析见表6，结果表明，乙醇浓度及洗脱流速对常春藤皂苷C的洗脱效果影响显著，而洗脱液体积对洗脱效果影响不大。另外，正交设计9组试验的纯度值均为45%左右，方差分析无显著性，因此忽略对纯度的影响。根据直观分析表及上述结果分析得出HPD-100树脂对常春藤皂苷C最佳纯化工艺条件为A3B3C1，即乙醇浓度为80%、洗脱体积为7 BV，洗脱流速为1 BV/h。

表5 正交试验结果及极差分析Tab 5 Theresultsoforthogonalexperiment试验号ABC回收率(%)111180 2212276 0313375 6421276 7522375 9623181 9731380 7832183 4933281 8K177 26779 20081 833K278 16778 16778 167K381 96779 76777 400极差(R)4 7001 3344 433 注：Kn=∑提取率n，n为因素的因子。 极差R=maxRn-minRn

表6 正交试验方差分析表Tab 6 Varianceanalysisoforthogonalexperiment方差来源偏差平方和自由度F值显著性A乙醇浓度37 340224 453显著B洗脱体积2 68721 760C洗脱流速33 687222 061显著误差1 532

4 结论与讨论

通过对七种不同型号树脂对常春藤皂苷C的静态吸附与解吸性能的比较研究，确定了HPD-100树脂为纯化常春藤皂苷C的最佳树脂，其吸附率为81.9%，解吸率为96.7%。通过动态吸附对影响纯化效果的pH、上样体积、洗脱液浓度、洗脱体积、洗脱流速进行深入研究，最终确定HPD-100树脂对常春藤皂苷C纯化的最佳条件：上样体积为6 BV，洗脱液乙醇浓度为80%，洗脱体积为7 BV，洗脱流速为1 BV/h。

童星[11]系统地比较了硅藻土纯化法、溶剂萃取-硅胶柱层析纯化法、聚酰胺纯化法、大孔吸附树脂纯化法纯化常春藤皂苷类化合物的效果，最终确定AB-8型大孔吸附树脂纯化常春藤中皂苷类化合物效果最好。本研究在此基础上进一步深入研究大孔吸附树脂对常春藤皂苷的纯化效果，并筛选出效果更优的HPD-100型树脂。通过对HPD-100树脂纯化常春藤皂苷C的各影响因素的深入研究，优化了常春藤皂苷C的纯化工艺，为下一步的实验研究奠定了良好的基础，同时也为工业化生产常春藤皂苷C提供了参考依据。

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PurifyingprocessofhederacosideCbymacroreticularresin

ZENG Jiangang1， SUN Huapeng2， RUAN Qinmei2， ZHANG Min3， ZHONG Xiaohong2

(1.Forestry Bureau of Hanshou County， Hanshou 415900， China； 2.Hunan Agriculture University， Changsha 410128， China； 3.Hunan Academy of Forestry， Changsha 410004， China)

The best macroreticular resin was selected by comparing adsorption and elution performance of seven kinds of macroreticular resin through static adsorption experiment.And purifying process parameters such as the pH and volume of sample loading，concentration of washing solution，elution volume，and elution flow rate were optimized through dynamic state absorbance experiment.The results showed that HPD-100 macroreticular resin had the best adsorption and elution performance.The optimum conditions of purification of hederacoside C were sample loading volume on 6 BV，elution volume on 7 BV with 80% ethanol，elution velocity was 1 BV/h.

hederacoside C； adsorption； elution； macroporous resin

2015-11-30

湖南省教育厅科研项目(15A089)；湖南省研究生科研创新项目(CX2014B290)。

曾建刚(1988-)，男，湖南武冈人，硕士，研究方向为药用植物开发与利用。

钟晓红，教授，博士生导师；E-mail：xh-zhong@163.com

TQ 464.3

A

1003-5710(2016)01-0053-08

10.3969/j.issn.1003-5710.2016.01.000

(文字编校：张 珉)