甘蓝型油菜高/低含油量近等基因系构建及鉴定

刘紫君,咸拴狮,王耀辉,范建春,王景雪,杜春芳

(1.山西大学 生命科学学院,山西 太原 030006;2.山西省农业科学院 棉花研究所,山西 运城 044000)



甘蓝型油菜高/低含油量近等基因系构建及鉴定

刘紫君1,咸拴狮2,王耀辉1,范建春2,王景雪1,杜春芳2

(1.山西大学 生命科学学院,山西 太原 030006;2.山西省农业科学院 棉花研究所,山西 运城 044000)

为了探讨油菜种子中脂肪酸代谢调控的机制,发现有价值的高油基因,为高油育种研究提供基础材料,构建了甘蓝型油菜高/低含油量近等基因系。以高油品系NJ9为基础试材,连续自交2代后,选择农艺性状基本一致、含油量不同的姐妹系30份,进行连续自交和含油量的选择,最终获得9份拟近等基因系材料。以来源于芸薹属DB公共数据库的156对SSR引物对9份拟近等基因系株系材料进行扩增,筛选出32对引物用于近等性分析。基于32对SSR引物PCR扩增结果,经过遗传相似性系数估算以及聚类分析,结果显示,9份拟近等基因系试材遗传相似性系数均为0.85～0.94,其中,YC13-554和YC13-559的遗传相似性系数最大,为0.94,确定其为近等基因系。成熟期农艺性状调查结果,进一步确定YC13-554和YC13-559为高/低含油量近等基因系。结果表明,连续自交和定向选择的方法可用于构建近等基因系,丰富了近等基因系的来源。

油菜;近等基因系;近等性分析;SSR分子标记;遗传相似系数

油菜作为一种重要的油料作物,在世界范围内广泛种植,是仅次于大豆的第二大植物油脂来源。油菜籽中丰富的油酸、亚油酸对人体具有重要的保健作用[1-3]。因此,油菜的含油量研究及其高油品种选育逐渐成为研究热点。

国内从20世纪80年代以来,加强了含油量的育种工作,目前我国油菜育种者已经选育了一批含油量高达50%～60%的优良品系和高产杂交种[4],尤其是中国农业科学院油料作物研究所王汉中研究员选育的油菜品系YN171,含油量高达64.8%,刷新了油菜含油量最高世界纪录。随着高油育种的不断深入,含油量调控机制不明、高油资源匮乏等问题不断凸显。利用近等基因系,从基因水平研究含油量调控机制、聚合优良基因将是进一步提高油菜含油量的有效方法。由于近等基因系的遗传背景相似,只有少数基因间有差异,因此,近等基因系在植物育种、分子标记、基因克隆和基因调控机理研究等领域中具有广泛的应用前景[5-7]。

本试验利用连续自交的方法构建了一组甘蓝型油菜含油量不同的拟近等基因系,并利用SSR标记技术对所构建的拟近等基因系进行鉴定,结合农艺性状分析,确定了高含油量/低含油量2个近等基因系,旨在为进一步研究油菜种子中脂肪酸积累的机制提供理论依据,并为油菜高油品种选育提供基础材料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验用于构建近等基因系的基础试材为NJ9,由山西省农业科学院棉花研究所油菜育种课题组从江苏省农业科学院引进的高代育种材料。

用于近等性分析的9份拟近等基因系材料来自于NJ9高代自交姐妹系。分别是:YC13-554、YC13-559、YC13-5142、YC13-5145、YC13-6109、YC13-6113、Y13-6146、YC13-6147、YC13-9133。

1.2 试验方法

1.2.1 近等基因系构建 山西省农业科学院棉花研究所油菜课题组2009年以外引的油菜高代自交系NJ9为原始试材,首先进行2代的自交驯化。随后选择适应性好、整齐一致的自交材料,然后以此为基础群体进行品质分析,从中选出30个农艺性状基本一致的单株;在翌年对这30个单株继续进行自交和选择,其原则是:农艺性状相同,含油量向2个方向选择(高含油量和低含油量)。

1.2.2 总DNA提取 供试材料播种于花盆中,待幼苗长到3～5片真叶时,取幼嫩叶片,用CTAB法提取基因组总DNA,备用[8]。

1.2.3 SSR扩增反应条件的优化 SSR引物的选取参考文献[9]进行:从芸薹属(Brassica) DB公共数据库(http://brassica.bbsrc.ae.uk/cgi-binace/searches/browser/BrassicaDB)中选取DNA序列并设计引物,共设计了156对引物。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

种植拟近等基因系试材,在幼苗期提取基因组总DNA。以总DNA为模板,用156对SSR引物进行扩增,重复2次,筛选扩增带型清晰易辨、重复性好的SSR引物备用。同时对PCR扩增反应的条件进行优化。

以筛选到的SSR引物和优化的PCR反应条件重新对拟近等基因系总DNA进行PCR扩增。PCR产物采用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。凝胶采用银染检测,数码相机拍照保存。

1.2.4 数据处理 用筛选出来的引物进行PCR扩增。凝胶电泳图谱中,扩增出来的每一条条带代表引物的1个结合位点,同时被视为有效的分子标记。同1对引物的扩增产物中电泳迁移率一致的被视为具有同源性[10];所有引物检测到的每1个条带视为1个等位变异。将凝胶电泳图转换为电子图谱。以(0,1)矩阵标记结果,电泳图谱中的清晰条带记为“1”,无带记为“0”。用NTSYSpc 2.10软件计算遗传相似性系数和遗传距离指数,使用非加权组平均法UPGMA进行聚类分析[11]。

1.2.5 农艺性状鉴定 2015年在成熟期对选定的近等基因系随机选取10株进行农艺性状和产量性状的测定。测定项目包括:株高、有效分枝数、第1次有效分枝部位高度、主花序有效长度、主花序有效角果数、全株有效角果数、每果粒数、千粒质量。

2 结果与分析

2.1 拟近等基因系构建

NJ9在运城地区长势较弱,适应性较差,经过2年对自交后代进行整齐度和适应性的驯化和选择,从中选出了长势强、整齐度高、抗寒耐病性好的YC10-428品系。2011年在YC10-428自交后代中选择了农艺性状整齐一致的30个单株进行套袋自交。收获单株后,连续2年通过对自交后代的农艺性状和含油量进行分析,共选择了9份含油量不同的拟近等基因系:YC13-554、YC13-559、YC13-5142、YC13-5145、YC13-6109、YC13-6113、Y13-6146、YC13-6147、YC13-9133。2014年对这些株系进行进一步的品质分析,结果发现,这些拟近等基因系试材农艺性状高度相似,但在含油量上差异较大(表1)。

表1 拟近等基因系种子油脂成分分析

注:表中数据全部来源于FOSS近红外分析仪TR-3750测定的结果;负值表示含量很低(因为FOSS近红外分析仪是根据标准曲线进行定量分析,如果含量低于标准曲线则测定值即为负值)。

Note:Data in the table are from the FOSS near infrared analyzer TR-3750 determination results;a negative value indicates that the content is very low(Because the FOSS near infrared analyzer in oil measurement accuracy is not very high,if the content is lower than the standard curve of measured value is negative).

2.2 拟近等基因系的近等性分析

2.2.1 SSR引物筛选 为了鉴定选择的拟近等基因系是否为近等基因系,本试验利用SSR分子标记技术对这些试材进行了鉴定。首先进行了引物筛选,以9份甘蓝型油菜拟近等基因系试材总DNA为模板,对156对SSR引物进行筛选,共选到32对条带清晰、重复性好的引物(表2)。

表2 SSR引物名称及等位基因数

2.2.2 拟近等基因系分子检测 按照1.2.3的方法,对SSR扩增反应条件进行了优化,结果表明,SSR分子标记的PCR最佳反应体系为25 μL,包含总DNA模板(50 ng)1 μL,10×ESTaqBuffer 2.5 μL,10 mmol/L dNTPs 0.5 μL,2.5 U/μL ESTaqDNA聚合酶0.25 μL,10 mmol/L SSR上游引物0.5 μL,10 mmol/L SSR下游引物0.5 μL,超纯水 18.75 μL。PCR扩增反应的最佳反应条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35个循环;72 ℃延伸7 min。用筛选出来的重复性好、扩增条带清晰的32对SSR引物对9份油菜试材进行PCR扩增。图1为以9份甘蓝型油菜拟近等基因系试材为模板,以SSR17、SSR18、SSR19为引物,进行PCR扩增的结果。

1～9.拟近等基因系材料YC13-9133、YC13-5142、YC13-6147、YC13-6146、YC13-5145、YC13-6113、YC13-6109、YC13-554和YC13-559;M.DNA Marker。

1-9.Near-isogenic line meteral YC13-9133,YC13-5142,YC13-6147,YC13-6146,YC13-5145,YC13-6113,YC13-6109,YC13-554 and YC13-559;M.500 bp DNA Marker.

图1 拟近等基因系的SSR引物17,18,19的PCR扩增结果

Fig.1 The result of amplification of SSR primer 17,18,19 with near-isogenic-line

由图1可知,所有引物共扩增出614条条带,其中,多态性条带93条;平均每对引物扩增出2.9条多态性条带。

2.2.3 拟近等基因系的遗传相似性及聚类分析 按照1.2.4的方法,对获得的SSR电泳图进行分析,绘制聚类图谱,结果如图2所示。

图2 拟近等基因的遗传相似性及SSR聚类分析结果

从图2可以看出,9份油菜材料的遗传相似性系数均为0.85～0.94。其中,在相似性系数0.85水平上将上述9份油菜材料分为2组,Ⅰ组包括YC13-9133和YC13-6147;Ⅱ组包括YC13-5142、YC13-6146、YC13-6113、YC13-6109、YC13-554、YC13-559、YC13-5145。在相似性系数为0.866水平上,将第Ⅱ组分为2大亚组,其中，YC13-5145单独聚为第1亚组,YC13-5142、YC13-6146、YC13-6113、YC13-6109、YC13-554、YC13-559为第2亚组;在0.882水平上将第2亚组再次分为2组,其中YC13-554、YC13-599聚为1组,YC13-5142、YC13-6146、YC13-6113、YC13-6109聚为另1组。表明所有9份拟近等基因系材料的亲缘关系很近,其中,YC13-554和YC13-559的遗传相似性系数最大,达到了0.94,可以认为YC13-554和YC13-559为所构建的拟近等基因系中最优近等基因系,可作为高含油量/低含油量近等基因系在遗传研究中应用。

2.3 近等基因系农艺性状分析

为了进一步确认近等基因系构建结果,2015年收获前对YC13-554、YC13-559这2个近等基因系进行了农艺性状的单株调查分析,每份试材在成熟期取10株进行田间调查和考种分析,其结果列于表 3。

表3 农艺性状分析

从表3可以看出,试材YC13-554和YC13-559 的各农艺性状表现基本一致,没有明显差异,证明近等基因系的选育成功,可以用于今后对调控油菜含油量的相关基因进行研究。

3 讨论

近等基因系的构建方法有回交法、突变体中筛选等。自1988年Young等[12]和 Muehlbauer等[13]提出近等基因系以来,近等基因系在甘蓝型油菜研究中已有应用[14]。张洁夫等[15]利用杂交高代自交系构建了甘蓝型油菜无花瓣近等基因系;甘莉等[16]利用回交转育的方法构建了抗(耐)菌核病的油菜近等基因系材料。笔者利用连续自交的方法成功构建了甘蓝型油菜含油量的近等基因系,这是一种可行的构建近等基因系的方法,丰富了近等基因系的选育方法,为后续对油菜含油量的相关基因研究提供了优异的种质材料。

SSR分子标记技术具有多态性丰富、重复性好、共显性遗传、覆盖整个基因组、操作简单等优点,因此,被普遍应用在遗传多样性的研究领域,例如Piquemal等[17]利用240对SSR引物构建了甘蓝型油菜遗传图谱;陈勋等[18]利用42对SSR引物对59个甘蓝型油菜进行分析,比较了春性和半冬性甘蓝型油菜的遗传差异。龙卫华等[19]利用SSR分子标记技术对油菜MI细胞质雄性不育恢复基因近等基因系进行了鉴定。为了验证所构建的近等基因系,选择了SSR分子标记技术对所构建的拟近等基因系进行了近等性分析,确定出YC13-554和YC13-559这2个近等基因系。研究结果还说明,利用SSR分子标记与农艺性状相结合的方法鉴定近等基因系,是一种简单有效的鉴定方法。

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Construction and Identification of Near-isogenic Lines of High/Low Oil Content inBrassicanapusL.

LIU Zijun1,XIAN Shuanshi2,WANG Yaohui1,FAN Jianchun2,WANG Jingxue1,DU Chunfang2

(1.College of Life Sciences,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;2.Cotton Research Institute,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Yuncheng 044000,China)

To explore the mechanism of regulation of fatty acid metabolism,find valuable high oil genes and provide based material for high quality breeding inBrassicanapusL.,the near-isogenic lines of high/low oil content was constructed.After continuous self crossing two generations,30 sister lines with same agronomic traits and different oil content were chosen based on high oil line,NJ9.Final nine near-isogenic line were obtained.156 pairs of SSR primers derived fromBrassicaDB public databases were used for PCR amplification of nine protocol near-isogenic line meterials,and 32 pairs of primers were screened for near-isogenic analysis.The results of genetic similarity coefficient estimation and clustering analysis,based on PCR amplification result,showed that the genetic similarity coefficients of 9 candidate strains were between 0.85 and 0.94,and the genetic similarity coefficient of YC13-554 and YC13-559 was 0.94,which was identified as near isogenic line.Based on the results of the investigation and analysis of agronomic traits in the mature period,the YC13-559 and YC13-554 were identified as high oil content and low oil near isogenic line.This study proves that using the method of continuos self cross and directional selection could be used to build nearly-isogenic lines and enriched the resource of nearly-isogenic lines.

BrassicanapusL.;Near-isogenic line;Near-isogenic analysis;SSR molecular marker;Genetic similarity coefficient

2016-05-20

山西省科技攻关项目(20140311010-4)

刘紫君(1992-),女,山西沁水人,在读硕士,主要从事植物分子生物学研究。

王景雪(1961-),女,山西新绛人,教授,博士，主要从事植物分子生物学研究。

杜春芳(1974-),女,山西芮城人,副研究员,博士，主要从事油菜遗传育种研究。

S56

A

1000-7091(2016)05-0129-05

10.7668/hbnxb.2016.05.019