大果水晶梨褐色果皮突变体木质素合成相关基因的组织特异性表达分析

刘炳旭，于凤鸣，张立彬，武军凯，宋立琴，肖 啸，杜晓东

(1.河北科技师范学院 生命科技学院，河北 秦皇岛 066004；2.河北科技师范学院 园艺科技学院，河北 秦皇岛 066004；3.河北省农林科学院 农业信息与经济研究所，河北 石家庄 050051)



大果水晶梨褐色果皮突变体木质素合成相关基因的组织特异性表达分析

刘炳旭1，于凤鸣1，张立彬2，武军凯2，宋立琴2，肖 啸2，杜晓东3

(1.河北科技师范学院 生命科技学院，河北 秦皇岛 066004；2.河北科技师范学院 园艺科技学院，河北 秦皇岛 066004；3.河北省农林科学院 农业信息与经济研究所，河北 石家庄 050051)

为研究木质素合成相关基因(PAL1、PAL2、CAD、POD、4CL)在大果水晶梨褐色果皮突变体中的表达特性，并为研究梨褐色果皮形成机制奠定基础。按照RNA试剂盒法提取果皮、花、叶片、果肉、枝条韧皮部中总RNA；利用DNAMAN和Primer 5.0软件设计特异引物；使用实时荧光定量PCR技术研究基因的表达。结果表明，PAL1、PAL2、CAD、POD、4CL的最高相对表达量均出现在果皮中；果皮和果肉中POD的相对表达量极显著高于其他基因，花、叶片和枝条韧皮部中CAD的相对表达量极显著高于其他基因。综上所述，大果水晶梨褐色果皮突变体木质素合成相关的5个酶基因在果皮、果肉、叶片、花和枝条韧皮部中的表达具有明显的组织特异性，这些基因可能与大果水晶梨褐色果皮的形成关系密切。

大果水晶梨褐色果皮突变体；木质素合成关键酶；基因；反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)；组织特异性表达

果实的果皮色泽是重要的农艺性状和商品外观品质之一，培育不同色泽果皮梨满足不同消费者的需求是梨育种的重要目标之一。根据果皮的不同颜色，梨可以分为绿皮梨、褐皮梨和红皮梨。欧洲国家多为红皮梨，亚洲国家多为绿皮或褐皮梨。其中，砂梨主要有绿皮和褐皮两大主群，一般情况下，成熟的砂梨多为褐皮梨。

大果水晶梨属于砂梨系统，是1991年由韩国从新高梨(褐色果皮)选育的1个绿梨芽变品种。本课题组在绿皮的水晶梨中发现1个褐色果皮变异植株(图1)，经嫁接鉴定(图2)，褐色变异性状稳定。

左.原品种；右.褐色突变体。

图2 褐色突变体(左)嫁接在原品种(右)上

目前，对于梨褐色果皮形成，已有一些报道。张智涛等[1]研究发现，大果水晶梨褐色果皮突变体在果皮表面多覆盖了一层木栓层，突变体果皮中木质素的含量高于原品种。刘晓娜等[2]报道，木质素是苯丙烷类代谢途径中的次生代谢物，由苯丙烷代谢途径中一些酶促反应合成，其中，PAL、CAD、4CL、POD等是关键酶。李晓峰等[3]以砀山酥梨及其芽变品系锈酥为材料，研究果皮的褐色形成机理，发现锈酥果皮褐色形成与果皮中木质素积累及相关酶活性提高有关，果皮中 CCoAOMT 的增量表达是锈酥果实褐皮形成的重要原因之一。卢晓鹏[4]以桂花和脆绿2个砂梨品种为研究对象，发现木质素代谢途径中的关键酶——肉桂酰辅酶A还原酶基因的表达与木质素合成及石细胞形成相关。王新卫[5]发现，褐皮黄花梨果皮中PpyPAL1和PpyCCR表达量显著高于绿皮黄花梨果皮中的表达量。刘莉等[6]发现，锈酥(褐色果皮)果皮中木质素增量与PAL2、4CL1、CAD1 和POD4酶基因表达量存在极显著正相关性，PAL2、4CL1、CAD1 和POD4均参与了砀山酥梨与芽变锈酥果皮褐色的形成。本课题组李义红等[7]也对大果水晶梨及其褐色果皮突变体的PAL酶进行了基因克隆和定量表达分析研究等。由此可见，梨褐色果皮形成与木质素合成密切相关，不同的试验材料，褐色果皮的形成原因也各不相同，但是，最终都影响了木质素的合成。

本试验以大果水晶梨褐色果皮突变体试材，根据实验室已克隆的基因序列设计合成引物，利用QRT-PCR，将大果水晶梨褐色果皮突变体不同组织中与木质素合成相关的5个酶基因的表达与内参基因做相对定量，研究这些基因表达的组织特异性，为以后开展大果水晶梨褐色果皮形成机制的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2014年6月12日(果实发育的幼果期)，从河北省抚宁县代庄大果水晶梨园，分别取大果水晶梨褐色果皮突变体的果皮(不含果肉)、果肉、花、叶片(幼叶)、枝条(韧皮部)，经液氮处理并混合均匀后，保存于 -80 ℃超低温冰箱中，用于总RNA的提取。

1.2 试验方法

利用实时荧光定量QRT-PCR方法，分析木质素合成相关的5个酶基因在大果水晶梨褐色果皮突变体不同组织中的相对表达量。

1.2.1 引物设计 根据实验室已有的基因序列，选择不同于其他家族基因序列的特异区，利用DNAMAN和Primer 5.0软件设计引物，选用Actin作为内参，引物由中美泰和生物技术服务有限公司合成，引物序列见表1。

1.2.2 cDNA 第一链的合成 不同组织RNA的提取：提取RNA前，将所有玻璃容器、离心管和去离子水用焦炭酸二乙酯(DEPC)灭活RNase。称取1 g的材料置于含液氮的研钵中充分研磨成粉末状。按照RNA试剂盒提供的方法提取各个组织中的总RNA，采用非变性琼脂糖凝胶电泳方法检测总RNA的完整性。用核酸蛋白快速检测仪( Eppendorf Biophotometer)测定RNA的纯度( A260/280的值为1.8～2.0，说明RNA无污染)及浓度；用DEPC-ddH2O将RNA稀释到下一步合成cDNA时所需模板的浓度1.0 μg/μL，未使用的RNA保存于 -80 ℃超低温冰箱中备用。

表1 引物序列

去除基因组DNA:按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒提供的方法进行操作，具体反应体系见表2。

表2 去除基因组DNA反应体系

上述试剂混合均匀后，于PCR仪上42 ℃保温2 min。

反转录反应：按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒提供的方法进行，具体反应体系见表3。反应液的配制在冰上操作。

轻柔混匀后，将反应液置于PCR仪上，按照37 ℃，15 min；85 ℃ ，5 s的反应程序进行反转录反应。反转录产物于-20 ℃保存备用。

1.2.3 定量表达分析 按照TaKaRa SYBR Premix EX Taq 试剂盒方法进行操作。以Actin(GU830959)为内参[8]。反应采用两步法，在ABI Step One 实时荧光PCR仪上进行，95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，40个循环。在60 ℃进行荧光信号采集，反应结束后生成融解曲线。

表3 反转录体系

大果水晶梨褐色果皮突变体不同组织的样品各设置3个重复，分别对应1个内参，以ROX作为荧光校正，使用2-ΔΔCt法进行相对定量。

1.2.4 数据分析 数据采用SPSS 17.0和Excel，Sigmaplot软件进行统计和分析。利用ANOVA和LSD检验对果皮、花、叶片、果肉、枝条韧皮部间PAL1、PAL2、POD、CAD、4CL基因的相对表达量进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

用RNA试剂盒法分别提取了大果水晶梨褐色果皮突变体的果皮、花、叶片、果肉和枝条韧皮部中的总RNA，紫外检测A260/280都在2.00左右。由于组织不同，RNA浓度在0.5～2.0 μg/μL。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，18SrRNA和28SrRNA条带清晰(图4)，说明提取的大果水晶梨褐色果皮突变体的5个组织的RNA完整性较好，可用于下一步反转录试验。

图3 大果水晶梨褐色果皮突变体的

2.2 不同基因在不同组织中的表达分析

利用实时荧光定量PCR技术，分析大果水晶梨褐色果皮突变体果皮、花、叶片、果肉和枝条韧皮部中PAL1、PAL2、CAD、4CL、POD5个酶基因的相对表达量。结果表明，5个基因在5个组织中均有表达，是组成型基因，但相对表达量各异(图4)。

PAL1基因在果皮中的相对表达量最高，在果肉、花、枝条韧皮部、叶中依次降低(图4-A)。PAL1在果皮中的相对表达量极显著高于果肉、花、枝条韧皮部和叶；PAL1在果肉中的相对表达量极显著高于叶，显著高于花和枝条韧皮部，花和枝条韧皮部差异不显著，但两者均极显著高于叶中的相对表达量。

PAL2基因在果皮中的相对表达量最高，在花、叶、枝条韧皮部、果肉中依次降低(图4-B)。果皮PAL2相对表达量极显著高于花、叶、枝条韧皮部和果肉；花中PAL2极显著高于叶、枝条韧皮部和果肉；叶中PAL2极显著高于果肉，但与枝条韧皮部差异不显著；果肉和枝条韧皮部PAL2差异不显著。

CAD基因在果皮中相对表达量最高，在果肉、叶、花、枝条韧皮部中依次降低(图4-C)。果皮CAD相对表达量极显著高于果肉、叶、花、枝条韧皮部；果肉、叶、花、枝条韧皮部CAD相对表达量差异不显著。

POD基因在果皮中的相对表达量最高，在果肉、枝条韧皮部、叶、花中依次降低(图4-D)。果皮POD相对表达量极显著高于果肉、枝条韧皮部、叶、花；叶、花和枝条韧皮部POD差异不显著，但三者均显著低于果肉中的相对表达量。

4CL基因在果皮中的相对表达量最高，果肉、枝条韧皮部、叶、花依次降低(图4-E)。果皮4CL基因的相对表达量极显著高于果肉、枝条韧皮部、叶、花；果肉中4CL极显著高于花，显著高于叶，但与枝条韧皮部差异不显著；枝条韧皮部中4CL显著高于花，但与叶差异不显著；叶和枝条韧皮部中4CL相对表达量差异不显著。

相同组织中不同基因的相对表达量也有差异。果皮中，POD的相对表达量最高，CAD、PAL1、4CL、PAL2依次降低(图4-F)。其中POD的相对表达量极显著高于CAD、PAL1、4CL、PAL2；CAD显著高于PAL1、4CL、PAL2；4CL和PAL1差异不显著，但两者均显著高于PAL2的相对表达量。

花中CAD基因的相对表达量最高，PAL1、POD、PAL2、4CL依次降低(图4-G)。CAD的相对表达量极显著高于PAL1、POD、PAL2、4CL；POD和PAL1差异不显著，但两者均极显著高于PAL2和4CL，而4CL和PAL2差异不显著。

果肉中POD的相对表达量最高，CAD、PAL1、4CL、PAL2依次降低(图4-H)。其中，POD极显著高于CAD、PAL1、4CL、PAL2；CAD极显著高于4CL、PAL2，显著高于PAL1；PAL1、4CL、PAL2三者的相对表达量差异不显著。

叶中CAD的相对表达量最高，POD、4CL、PAL1、PAL2依次降低(图4-I)。其中POD、4CL、PAL1、PAL2差异不显著，但均极显著低于CAD的相对表达量。

枝条韧皮部中CAD的相对表达量最高，POD、PAL1、4CL、PAL2依次降低(图4-J)。CAD相对表达量极显著高于POD、PAL1、4CL、PAL2；POD、PAL1、4CL三者差异不显著，但均极显著高于PAL2的相对表达量。

3 讨论与结论

植物PAL基因是1个多基因家族，通常为2～5个成员，来源不同的PAL具有不同的分子量和结构[9]。一般情况下，不同植物的PAL活性不同，同一种植物不同部位PAL活性也不同[10]，通常PAL在幼嫩部位的活性比较高[11]。有壳和裸仁美洲南瓜PAL在叶片、茎、根、花瓣中均表达，在叶片和花瓣中的表达水平较高[12]；夏枯草PAL基因在茎、叶中均表达，在茎中的相对表达量高于叶的表达量[13]；在蝴蝶兰叶片发育过程中，PAL基因的相对表达量呈先下降后上升的趋势[14]。试验发现，大果水晶梨的PAL基因家族至少有2个成员，PAL1、PAL2基因在果皮中表达量最高，PAL2在果肉中表达量最低。这与上述植物在叶片中的表达量高的模式相同，可能功能相似。而PAL1在叶片中的表达量最低，与上述植物叶片中的表达量最高的模式不同，可能与物种不同有关。但PAL1与PAL2基因的表达模式不同，说明同一家族中的不同基因具有组织差异性，这与吕萌[15]的报道一致。

植物中4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase，4CL)通常以家族形式存在，参与苯丙烷代谢途径中不同代谢产物的合成，在植物组织中具有表达差异性。如：洋麻4CL基因在发育阶段的所有组织中均有表达，在茎和根中的相对表达量最高，在叶和成熟的花中相对表达量最低[16]；烟草4CL1和4CL2基因在木质部中的相对表达量最高，其次是韧皮部，在上部叶表达水平最低[17]；百合Ls4CL基因在茎中相对表达量最高，其次是根、叶片、花蕾中，在鳞茎中的相对表达量最低[18]；4CL基因在东方山羊豆的组织中均有表达但表达水平不同，在根中相对表达量最高，其次是茎，叶中相对表达量最低[19]。本试验克隆得到了一个4CL基因，该基因在果皮和果肉中的表达量最高，其次是茎和叶片，在花中的表达水平最低，其表达模式和功能可能与洋麻4CL相似。

图中不同小写字母表示0.05水平差异显著；大写字母表示0.01水平差异显著。

肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)是木质素合成特异途径下游的关键酶，在NADPH的作用下，催化多种不同的肉桂醛(香豆醛，芥子醛，松柏醛等)及其衍生物生成木质素单体前体物质。CAD基因表达的研究多集中在不同组织部位、不同生育时期、不同品种等方面。其中，毛果杨的15个CAD基因中，CAD7在叶片和叶柄中相对表达量较高，CAD9在叶片中相对表达量最高，CAD12和CAD13在叶片中相对表达量最高[20]；杨树CAD基因在叶、茎、外表皮、木质部等组织中均表达，且表达水平不同[21]；丹参CAD基因在根、茎、叶中均有表达，在根部的相对表达量最高，其次是叶，茎中最低[22]；甜瓜cmCAD5和cmCAD2在所有组织中均表达，在果实中的表达量最高，与果实的发育有密切关系，且cmCAD2与甜瓜果实木质素合成有关，cmCAD5是花生长发育及香气合成过程中的重要基因[23]。本试验结果还表明，CAD在果皮和果肉中表达量最高，其次是叶和花，在茎中表达量最低，与上述植物表达模式相似，可能功能相近。

过氧化物酶(Peroxidase，POD)是1个多基因家族的氧化还原酶，参与脂质过氧化作用、植物的呼吸作用、光合作用、生长素的降解及正常代谢和应激反应，包括植物体内将3种醇单体脱氢聚合成木质素。过氧化物酶具有多种同工酶并有种属、组织以及发育时期特异性。Passardi等[24]研究报道，茶树POD57是1个组成型基因，在根中相对表达量最高，在茎、叶片中依次降低，与拟南芥表达情况相似。心里美萝卜地上和地下部分POD基因的相对表达量差异显著，在结荚期木质部中的相对表达量最高[25]。油菜POD基因在根中的相对表达量最高，在茎、花、叶的相对表达量依次降低[26]。目前，主要集中于研究梨POD酶学特性、分布和同工酶谱带，对梨POD基因的克隆及定量表达分析研究很少[27-29]。本研究克隆得到了大果水晶梨褐色果皮突变体的1个POD基因，该基因在果皮和果肉中表达量高，其次为茎和叶，在花中表达量最低，与上述植物表达模式均相同。

利用RT-PCR相对定量分析方法，本试验首次以大果水晶梨褐色果皮突变体作为试验材料，系统地研究了PAL1、PAL2、CAD、4CL、POD基因在不同组织中的表达规律。结果发现，这5个基因具有明显的组织特异性。此外，这5个基因均在果皮中具有最大表达量，可能与果皮的发育具有重要关系，应该在后续进行褐色果皮形成机制的研究中进行重点关注。

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Tissue Specificity Express Analysis of Enzyme Genes Related to Lignin Biosynthesis in Suisho Pear Brown Pericarp Mutant

LIU Bingxu1,YU Fengming1,ZHANG Libin2,WU Junkai2,SONG Liqin2,XIAO Xiao2,DU Xiaodong3

(1.College of Life Science and Technology,Hebei Normal University of Science & Technology,Qinhuangdao 066004,China;2.College of Horticultural Science and Technology,Hebei Normal University of Science & Technology,Qinhuangdao 066004,China；3.Institute of Agricultural Information and Economy,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang 050051,China)

In order to reveal the expression characteristic of genes (PAL1,PAL2,CAD,4CL,POD) related to lignin biosynthesis in brown pericarp mutant of Suisho pear,and provide the basis for further studying pear brown pericarp formation mechanism.RNA was extracted from different tissues according to RNA extraction kit (EASY spin,Biomed),primers were designed with Primer 5.0 and DNAMAN,expression pattern of genes were analyzed by QRT-PCR.Among the different tissues and organs,the highest relative expression ofPAL1,PAL2,CAD,4CL,PODgene appeared in peels.In peels and pulps,the relative expression ofPODgene was extremely significantly higher than the other genes.In flowers,leaves and branches phloem,the relative expression ofCADwas extremely significantly higher than the other genes.The study suggested that the expression pattern ofPAL,CAD,4CLandPODhad significant tissue-specific in the five selected tissues and organs,and these genes may be associated with the formation of Suisho pear brown peel closely.

Brown pericarp mutant of Suisho pear；Key enzymes of lignin biosynthesis；Gene；Reverse transcription-PCR(RT-PCR)；Tissue specificity expression

2016-06-07

河北省教育厅重点项目(No.ZH2012005)

刘炳旭(1990-),女,河北邯郸人,在读硕士,主要从事果树分子生物学研究。

于凤鸣(1966-),男,河北昌黎人,教授,主要从事果树分子生物学研究。

杜晓东(1967-)，女，河北赵县人，副研究员，主要从事农业信息与果树学研究。

Q78;S661.03

A

1000-7091(2016)05-0028-07

10.7668/hbnxb.2016.05.005