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气相色谱-串联质谱法测定卷烟主流烟气中8种生物碱

2016-11-16姬厚伟张丽刘剑王芳满杰刘纳纳韩伟彭黔荣

中国烟草学报 2016年6期
关键词:烟碱生物碱卷烟

姬厚伟,张丽,刘剑,王芳,满杰,刘纳纳,韩伟,彭黔荣

贵州中烟工业有限责任公司技术中心, 贵阳市小河区开发大道96号 550009

气相色谱-串联质谱法测定卷烟主流烟气中8种生物碱

姬厚伟,张丽,刘剑,王芳,满杰,刘纳纳,韩伟,彭黔荣

贵州中烟工业有限责任公司技术中心, 贵阳市小河区开发大道96号 550009

建立了超声萃取-气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)同时测定卷烟主流烟气中8种生物碱(烟碱、降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、假木贼碱、新烟草碱、2’3-联吡啶和可替宁)的分析方法。捕集了卷烟主流烟气总粒相物的剑桥滤片经8%的NaOH溶液浸泡后,用乙酸乙酯超声萃取,在多反应监测(MRM)模式下进行GC-MS/MS分析,内标法定量。结果表明:8种生物碱线性良好,r2为0.9991~0.9999,方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.02~2.47 μg/支和0.06~8.22 μg/支,加标回收率为97.0%~125.5%,相对标准偏差为0.5%~6.8%。该方法操作简便、灵敏,适合用于卷烟主流烟气中8种生物碱释放量的测定。

卷烟;主流烟气;总粒相物;超声萃取; GC-MS/MS;生物碱

生物碱是卷烟主流烟气中一类直接影响烟气化学性质和感官特征的烟草生物碱,主要有烟碱(nicotine)、降烟碱(nornicotine)、麦斯明(myosmine)、二烯烟碱(nicotyrine)、假木贼碱(anabasine)、新烟草碱(anatabine)、可替宁(cotinine)、2,3´-联吡啶(2,3´-dipyridyl)等,由烟丝中生物碱直接转移和烟丝高温裂解生成[1],准确测定卷烟主流烟气中生物碱对卷烟的吸食品质评价有重要作用。

目前报道的烟草生物碱分析方法主要有:气相色谱法[2-7]、气相色谱-质谱法[8-12]、高效液相色谱法[13-15]、离子色谱法[16-17]、毛细管电泳法[18-20]以及超临界流体色谱法[21-22]等。由于烟草和烟气中化学成分复杂,高灵敏度和高选择性的烟草生物碱分析方法一直是研究热点。近年来新的检测器被发展和应用于烟叶和烟丝中烟草生物碱的测定,如氮化学发光检测器[23]、串联质谱技术[24-27]等,而在卷烟主流烟气中应用鲜有报道。传统的方法存在前处理复杂、灵敏度和选择性低等不足,因此,本文基于气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)多反应监测(MRM)模式的高选择性和高灵敏度特点,建立了卷烟主流烟气中8种生物碱的检测方法,该方法简便、准确、高效,旨在为卷烟产品开发和维护提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

卷烟样品选自国内卷烟企业,其类型及常规烟气指标如表1所示。单料烟(表2)卷烟由贵阳卷烟厂卷制。

表1 卷烟样品类型及盒标常规烟气指标Tab.1 Types of cigarette samples and conventional ingredients in cigarette smoke mg/支

表2 单料烟产地、等级和年份Tab.2 Production area, grade and years of unblended cigarettes

二氯甲烷、甲醇、正己烷(均为色谱纯,天津市登科化学试剂有限公司),丙酮、环己烷、乙酸乙酯(色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司),甲基叔丁基醚(色谱纯,天津市富宇精细化工有限公司),氢氧化钠(分析纯,天津市登科化学试剂有限公司)。标准品:烟碱、降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、假木贼碱、新烟草碱、可的宁、2,3´-联吡啶、蒽-d10、 (纯度均≥99%,美国Sigma-aldrich)。

TSQ 8000型气相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司);RM20H型转盘吸烟机(配有CO自动分析仪)、Φ44 mm剑桥滤片(德国Borgwaldt公司); AG104电子天平(感量:0.0001 g,瑞士Mettler Toledo公司),超声波清洗仪(昆山超声波清洗机有限公司),高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

准确称取蒽-d100.05g,精确至0.0001 g,用二氯甲烷溶解后置于50 mL的容量瓶中,加入二氯甲烷定容,得到内标标准贮备溶液。

分别称取烟碱、降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、假木贼碱、新烟草碱、可替宁、2,3´- 联吡啶8种不同质量的生物碱标样见表3,精确至0.0001 g,用二氯甲烷溶解后分别置于10 mL容量瓶中,加入二氯甲烷定容,摇匀,得到标准贮备液。准确移取10, 20,50, 100, 200, 500 μL 混合生物碱标准贮备液于6只10 mL容量瓶中,分别加入100 μL内标溶液,用乙酸乙酯定容,摇匀,得到不同浓度梯度的生物碱混合标准溶液。

表3 8种生物碱的称取质量及标准贮备液浓度Tab.3 The weight of 8 alkaloids and concentrations of corresponding standard stock solutions

1.2.2 样品的前处理

按GB/T 5606.1—2004[28]的方法挑选卷烟烟支,并于温度(22±2) ℃和相对湿度(60±5)%的条件下平衡48 h;使用20孔道转盘吸烟机,按照GB/T 19609—2004[29]方法,采用ISO抽吸模式[30]抽吸卷烟。每种卷烟抽吸5支卷烟,主流烟气粒相物用1张剑桥滤片捕集;抽吸完成后,将1张剑桥滤片置于50 mL锥形瓶中,添加2 mL8%氢氧化钠溶液,浸泡10 min后再加20 mL乙酸乙酯和200 μL内标溶液,超声萃取30 min,5000 r/min离心5 min,取1.5 mL上清液过装有2 g无水硫酸钠的微孔过滤器后,用GC-MS/MS分析。分析条件为:

色谱柱:DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);进样口温度:280 ℃;载气:氦气(纯度≥99.999%);载气流速:1.0 mL/min,恒流模式;分流比:10︰1;进样量:1 μL;升温程序:100 ℃(3 min);传输线温度:280 ℃;离子源温度280 ℃;溶剂延迟:5 min;电离方式:EI源;电离能量:70 eV;Q2碰撞气:氩气(纯度≥99.999%);扫描方式:多反应监测(MRM)。8种生物碱和内标(IS)的保留时间及质谱参数见表4。

表4 8种生物碱及其内标的GC-MS/MS参数Tab. 4 GC-MS/MS parameters of 8 alkaloids and its internal standard

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

与GC-MS相比,GC-MS/MS灵敏度更高、选择性更好,降低了对前处理的要求,同时提高了定量分析的准确性[26]。本实验中需要优化的质谱参数主要有母离子、子离子和碰撞能量。首先,分别对标准储备液在m/z 30-400之间进行全扫描,确定目标化合物的保留时间和一级质谱图,并从一级质谱图中选择适当的离子作为母离子。其次,对选定的母离子用子离子扫描的方式,确定二级质谱图,从中选择适宜的离子作为子离子。对每一组母离子/子离子,在不同碰撞能量下扫描,选择响应信号最大的作为最优的碰撞能量。目标物和内标的母离子、子离子和碰撞能量见表4。图1为优化的质谱条件下,生物碱混合标样和烟草样品的总离子流色谱图(TIC),图2为烟草样品的多反应监测(MRM)色谱图。

图1 MRM模式下生物碱标样(A)及烟草样品(B)的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of alkaloid standards (A) and tobacco sample (B) under MRM mode

图2 烟草样品中生物碱的MRM色谱图Fig.2 Multiple reaction monitoring chromatograms of alkaloids in tobacco sample

2.2 NaOH溶液浓度的优化

生物碱为二碱基物质,在不同的酸碱度环境中常以质子化和非质子化两种形态存在。为了将质子化的生物碱游离出来,需要加入碱液调节烟气pH。本实验分别比较了不加NaOH和加2 mL 2.5%,5%,8%和10%的NaOH溶液对主流烟气中8种生物碱萃取效果的影响(见图3)。结果表明,加入NaOH溶液对烟碱、麦斯明、二烯烟碱、2,3´- 联吡啶、可替宁的萃取效果影响不大,而降烟碱、假木贼碱和新烟碱的萃取效率明显提高,这主要是因为生物碱中吡咯环氮的碱性比吡啶环的碱性强的多,而降烟碱、假木贼碱和新烟碱的吡咯环中的氮为仲胺氮,碱性较强,在烟气中主要以质子化形态存在。不同浓度的NaOH溶液对测定结果也有影响,综合比较发现,8%的NaOH溶液对8种生物碱的萃取效果最优。

图3 不同浓度NaOH溶液对主流烟气中8种生物碱萃取效果的影响Fig.3 Effect of different concentrations of hydroxide sodium solutions on extraction efficiency to 8 alkaloids in mainstream smoke

2.3 NaOH溶液浸泡时间的优化

实验对比了用8%NaOH溶液浸泡不同时间(0, 5,10, 15, 30 min)对8种生物碱萃取效果的影响(见图4)。结果表明,加入8%NaOH溶液后直接加入乙酸乙酯萃取,降烟碱提取仍不完全,对其他生物碱的提取效率影响不大。随浸泡时间的延长,降烟碱萃取率提高,且在10 min达到最大,再继续延长浸泡时间,各生物碱的萃取率出现不同程度的下降。因此,选择10 min为最佳的浸泡时间。

图4 NaOH溶液不同浸泡时间对主流烟气中8种生物碱萃取效果的影响Fig.4 Effect of different immerse time on extraction efficiency to 8 alkaloids in mainstream smoke

2.4 萃取溶剂的选择

选用二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、丙酮5种溶剂进行萃取效率的比较,溶剂萃取效率结果见图5。由图5可知,氯仿对烟碱、麦斯明、二烯烟碱、2,3´- 联吡啶、可替宁的萃取效果最好,但对降烟碱、假木贼碱和新烟草碱萃取效果最差。乙酸乙酯对8种生物碱的萃取效果均较高,且与水分层后在上层,易操作,毒性小,因此选择乙酸乙酯作为萃取溶剂。

图5 不同萃取溶剂对对主流烟气中8种生物碱萃取效果的影响Fig.5 Effect of different extraction solvent on extraction efficiency to 8 alkaloids in mainstream smoke

2.5 萃取时间的选择

对同一样品分别采取不同超声时间,选用乙酸乙酯作为萃取溶剂,其中超声时间选取5,10,15,30,45 min进行比较,结果见图6。随超声时间的增加,8种生物碱的提取效率逐渐增加,30 min时趋于稳定,且部分生物碱提取效率在45 min时有下降趋势,故选择超声时间为30 min。

图6 不同超声时间对主流烟气中8种生物碱萃取效果的影响Fig.6 Effect of different ultrasonic time on extraction efficiency to 8 alkaloids in mainstream smoke

2.6 工作曲线、检出限和定量限

分别对6个不同浓度生物碱混合标准溶液进行GC-MS/MS分析,采用内标法定量,以各自生物碱与内标的峰面积比为纵坐标(Y),各自生物碱浓度为横坐标(X,μg/mL)进行回归分析,得到8种生物碱的回归方程及其相关系数,如表5所示。由表5可知,8种生物碱标准曲线的线性关系良好,r2在0.9991~0.9999之间。将最低浓度的标准溶液稀释并进行GC-MS/MS分析,以3倍信噪比为方法的检出限(LOD),10倍信噪比为定量限(LOQ),则烟碱的LOD和LOQ分别为2.47 μg/支和8.22 μg/支。其余7种生物碱的LOD和LOQ分别为0.02~0.11 μg/支和0.06~0.36 μg/支。说明本方法具有较高的灵敏度,适合于定量分析。GC-MS/MS测定复杂样品时,基质成分可能对目标物响应值造成影响,进而影响分析的准确度和灵敏度。通过比较纯溶剂配制的标准溶液和标准添加法的工作曲线斜率来评价基质效应。纯溶剂配制的标准溶液回归方程斜率为k1,标准添加法回归方程斜率为k2,则基质效应(ME)=k2/k1。由表5可以看出,除2,3´- 联吡啶表现出极弱的增强效应外,其余7种分析物均表现为较弱的抑制效应,在0.86-0.99之间,抑制效应不明显,可以忽略。

表5 工作曲线和相关系数、方法的检出限、定量限及基质效应评价Tab.5 Linear equation and correlation coefficient, limit of detection and quantization and matrix effect

2.7 回收率和精密度

取已知卷烟主流烟气生物碱释放量的卷烟样品按照上述方法抽吸卷烟,并收集滤片,在滤片上按低、中、高3种添加水平添加标准溶液,然后按1.2.2对样品进行处理,每个添加水平平行测定6次,进行了回收率和精密度的测定,实验结果见表6。由表6可知,8种生物碱平均加标回收率为在97.0%~125.5%,平均相对标准偏差(RSD%)在0.5%~6.8%之间,可以满足定量需要。

表6 卷烟样品主流烟气中8种生物碱回收率与精密度(n=6)Tab.6 Recoveries and RSD for 8 alkaloids in mainstream smoke of cigarettes(n=6)

2.8 不同类型卷烟主流烟气中8种生物碱释放量

采用本方法测定了10种不同品牌,1种参比卷烟和10种单料烟主流烟气中8种生物碱的释放量,结果见表7和表8。其中,烤烟主流烟气中烟碱占总烟碱的98%左右,其次是2,3´- 联吡啶,降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、新烟草碱含量基本相当略高于可替宁,而假木贼碱含量最低。而混合型中降烟碱和麦斯明含量则高于其他5种微量生物碱(烟碱除外)。

表7 10种不同品牌和1种参比卷烟样品主流烟气中8种生物碱的释放量Tab.7 Analysis results of 8 alkaloids in mainstream smoke of 10 brands of cigarettes and 1 reference cigarette μg/支

表8 10种单料烟样品主流烟气中8种生物碱的释放量Tab.8 Analysis results of 8 alkaloids in mainstream smoke of 10 kinds of unblended cigarette μg/支

3 结论

建立了同时测定卷烟主流烟气总粒相物中8种生物碱的气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)分析方法。该方法操作简便、准确度高,分析速度快,适合于批量卷烟主流烟气总粒相物中8种生物碱释放量的测定。

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Simultaneous determination of eight alkaloids in mainstream cigarette smoke by gas chromatography-tandem mass spectrometry

JI Houwei, ZHANG Li, LIU Jian, WANG Fang, MAN Jie, LIU Nana, HAN Wei, PENG Qianrong
Technology Center, China Tobacco Guizhou Industrial Co., Ltd, Guiyang 550009, China

A method for simultaneous determination of 8 alkaloids, i.e. nicotine, nornicotine, myosmine, nicotyrine, anabasine, anatabine,2’3-dipyridyl and cotinine, in mainstream cigarette smoke by gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) was developed.The total particulate matters (TPMs) captured by Cambridge filter pads was immersed in 8% NaOH solution, and then extracted by ultrasound extraction with acetic ether and analyzed by GC-MS/MS under multi-reaction monitoring (MRM) mode, and quantified by internal standard method. Results showed that: the calibration curves showed good linearity for 8 alkaloids with correlation coefficients as 0.9991~0.9999. The limits of detection and limits of quantification for 8 alkaloids were 0.02~2.47 μg/cig and 0.06~8.22 μg/cig,respectively. Recoveries ranged from 97.0% to 125.5% with relative standard deviations (RSDs) from 0.5% to 6.8%. The proposed method was simple, sensitive and suitable for the determination of 8 alkaloids in cigarette mainstream smoke.

cigarette; mainstream smoke; total particulate matters (TPMs); ultrasonic extraction; gas chromatography-tandem mass spectrometry; alkaloids

姬厚伟, 张丽, 刘剑,等. 气相色谱-串联质谱法测定卷烟主流烟气中8种生物碱[J]. 中国烟草学报,2016,22(6)

贵州中烟工业有限责任公司科技项目“贵州中烟配方模块烟气中重要致香成分分析方法的研究”(201019)

姬厚伟(1978—),硕士,工程师,主要从事烟用材料及烟草化学分析研究,Tel:0851-83981473,Email: jihouwei@163.com

刘剑,博士,高级工程师,主要从事烟草及烟气化学分析,Tel:0851-83981463,Email:liuj1208@163.com

2016-01-22

:JI Houwei, ZHANG Li, LIU Jian, et al. Simultaneous determination of eight alkaloids in mainstream cigarette smoke by gas chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(6)

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