芯片级非对称场离子迁移谱技术快速识别不同霉变烟草

周沅桢，张强，羊一涛，李灵锋，汪小知

1 红云红河集团红河卷烟厂，云南省弥勒市桃园路50号 652399；2 云南瑞升烟草技术（集团）有限公司，昆明市高新开发区海源北路1699号 650106；3 浙江大学苏州工业技术研究院，江苏省苏州市高新区锦峰路8号5号楼 215000；4 浙江大学信息与电子工程学系，杭州市西湖区浙大路浙江大学玉泉校区微电子楼 310027

芯片级非对称场离子迁移谱技术快速识别不同霉变烟草

周沅桢1，张强2，羊一涛1，李灵锋3,4，汪小知4

1 红云红河集团红河卷烟厂，云南省弥勒市桃园路50号 652399；2 云南瑞升烟草技术（集团）有限公司，昆明市高新开发区海源北路1699号 650106；3 浙江大学苏州工业技术研究院，江苏省苏州市高新区锦峰路8号5号楼 215000；4 浙江大学信息与电子工程学系，杭州市西湖区浙大路浙江大学玉泉校区微电子楼 310027

建立了顶空进样法—芯片级非对称场离子迁移谱(Microchip-based FAIMS)技术快速识别霉变烟草。在常压条件下，以经过活性炭和分子筛净化的空气为载气，同时在正负离子模式下进行检测。在优化的条件下（载气流量2000 mL/min，顶空温度为25℃，样品气流为100 mL/min），对不同霉变程度烟草进行定性分析，建立识别规则，依据规则识别烟草霉变程度，识别率达90%以上，实现对203种烟草的快速检测。对得到不同烟草的特征峰，利用解析-气相色谱-质谱仪器（TD-GC-MS）定性分析不同霉变状态烟草的特征霉变物质，验证FAIMS测试结果。烟草特征峰在指定的CV值和DF值下，离子电流值值存在显著性差异，利于识别。方法重复性的相对标准偏差RSD≤5%。因此，FAIMS检测技术可用于快速识别霉变烟草的方法开发。

非对称场离子迁移谱；霉变烟草；识别

烟草霉变的预防和控制，一直是烟草行业中重要的课题。烟叶吸湿性强，烟叶中又含有微生物生长所需要的营养物质[1]，环境变化极易使烟草发生霉变。严重霉变的烟草甚至可能产生毒素，出现烟草安全问题[2]。传统验证烟草霉变检测的方法是眼看、手捏、鼻闻或检测菌落密度，这些方法耗时长，准确性低且具有滞后性[3]。近年出现以GC-MS法测定烟草霉变标记物植物甾醇的研究[4]， Meruva NK等利用CLSGC-MS对烟草中微生物菌类化学标记物[5]进行研究，此方法准确性较高，但前处理复杂，成本高，操作人员需要一定技术基础，难以满足烟草霉变快速检测的要求。

芯片级非对称离子迁移谱（Microchip-based Feild Asymmetric Ion Mobility Spectrometry，Microchipbased FAIMS）是一种在传统离子迁移谱基础上发展起来的气相离子分离技术，它是基于不同离子迁移率在常压高电场条件下呈非线性变化的特点，对正负离子同时进行扫描，离子在迁移区受非对称波形电场和补偿电压共同作用，到达检测器完成离子分离与识别。传统离子迁移谱存在仪器体积和灵敏度之间的矛盾，为提高灵敏度而增加迁移管长度和体积，使得检测时间延长、仪器功耗增大，相比之下，芯片技术与FAIMS技术相结合，仪器体积减小，耗能降低，缩短了检测时间，具有分析速度快、灵敏度高、低成本及无需复杂前处理的特点[6-7]。FAIMS技术在生物医药、环境检测及爆炸物毒品分析[8-11]等领域广泛应用，但目前在烟草霉变检测还未有应用。本文基于Microchip-based FAIMS技术，以经过活性炭和分子筛净化的空气为载气利用顶空进样法，选取烟草样本通过实验优化测试条件，依据优化后分析条件实现对203种烟草样品霉变的快速识别检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

（1）样品：203种不同霉变程度烟草（云南瑞升烟草技术（集团）有限公司提供），包括：63种霉变烟草，140种未霉变烟草。（烟草的霉变状态由云南瑞升烟草技术（集团）有限公司技术中心验证）；1-戊醇和吡啶均为分析纯（阿拉丁试剂）。

（2）仪器：FAIMS谱仪（苏州微木智能系统有限公司研制，配有63Ni电离源：FAIMS芯片迁移沟道尺寸参数：宽度35 µm，深度300 µm；芯片迁移区长度3.25 mm，宽度2.5 mm）。顶空进样装置（苏州微木智能系统有限公司制造）；Agilent7890A-5975C GC-MS（美国Agilent公司）；Markes Unity热解析仪（英国Markes公司）；Tenax-TA采样管（英国Markes公司）；无油空压机（上海欧谱力机械有限公司）；Scout SE电子天平（奥豪斯仪器有限公司，感量0.01 g）。

1.2 方法

测试样品气体由顶空进样装置产生：使用电子天平分别称取烟草样品各0.3 g，无需前处理，依次将烟草样品放入干净顶空进样器中进行分析。采用的测试条件为：

（1）FAIMS电压参数：射频电场强度可达60000 V/cm，扫描范围为最高射频电场（电场强度，DF%）的20%～65%，频率为25 MHz，直流补偿电压扫描范围为-6～+6 V。

（2）FAIMS检测条件：设置样品气流速为100 mL/min，载气流速为2000 mL/min，测试压强为常压，检测温度为25℃，同步记录FAIMS检测图谱信号。其中载气为经过活性炭和分子筛净化的空气。

（3）TD-GC-MS烟草霉变标记物筛查验证测试：用Tenax-TA吸附管分别对未霉变与霉变烟草在相同测试条件下的样品气体吸附采样，热解析仪解析脱附，利用GC-MS对样品气检测，对烟草霉变标记物及FAIMS识别结果进行对比判定。测试条件如下：

a.TENAX TA采样管采样条件：老化TENAX TA采样管，用抽气泵以100 mL/min抽气采样，连续采样30 min后用于TD-GC-MS分析。

b.吹脱捕集主要条件：吹脱气体为高纯氮气，解析时间为4 min，解析温度为250℃，吹脱时间4min，冷阱温度-10℃，线温150℃，阀温150℃。

c.气相色谱条件：HP-5MS气相色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，程序升温，80℃保持22 min，10℃/min升至260 ℃，保持20 min。传输线温度200℃。载气He气，流速1.2 mL/min，分流进样口，分流比5：1。

d.质谱条件：EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，全扫描采集模式，质量范围20 ～500 amu。

（4）烟草霉变识别：利用FAIMS识别软件对203种烟草样本测试结果进行判定，建立烟草信号识别规则点，分析图谱信号，判别烟草霉变程度。实验结果对比烟草验证结论，验证识别的正确率。

（5）方法重复性测试：选择1种烟草样品，在同一检测条件下，重复测试6次，根据检测得到正模式的峰图的离子电流值，用相对标准偏差RSD表示方法重复性的优劣。

2 结果与分析

2.1 FAIMS检测条件的优化

影响FAIMS检测的因素主要是气压，温度、湿度和流量，本实验是在常压下进行，所用载气是由无油空压机制得并经分子筛和活性炭处理的空气，可以确保湿度恒定。FAIMS仪器在出厂时已经对离子过滤器和检测器气温进行优化，通过加热热电阻保持在100±0.1℃。因此这里仅对样品温度和载气流量这两个因素进行优化，以仪器检测信号的分辨率和和响应值作为优化指标，选取1种烟草为优化对象。

2.1.1 顶空进样温度

考察 了温度为25℃，35℃，45℃，55℃和65℃对特征峰的影响。结果表明，随着温度升高203种烟草的特征信号减弱，干扰杂质峰响应信号增强。这是因为烟草成分较为复杂，当温度升高后，烟草含有的杂质也不断释放，在参与竞争反应离子的过程中，杂质分子争得的离子数目也在增加，响应信号逐渐增强，由于反应离子的总电荷数是固定的，使得烟草霉变特征峰的信号减弱，这个反应过程与测试物质的质子亲和能有密切关系[12-13]。图1可看出随着温度升高，特征离子电流值降低。因此实验选取25℃为最优的测试温度，该温度也表明仪器在实际测试中也可在室温下进行样品检测。

2.1.2 样品流量和载气流量

固定样品气流速为0.1 L/min，考察了载气流速为1.5 L/min、1.8 L/min、2.0 L/min、2.2 L/min和2.5 L/min对仪器灵敏度和分辨率的影响。结果见图2，在载气流速逐渐增加的过程中，烟草特征峰的离子电流值逐渐增加，当载气流速大于2.0 L/min离子电流值迅速降低，这是由于载气流速增加导致待测样品滞留时间减少，还未检测就被带离检测器，使得响应信号减小。同时，当载气流速较高时，会导致样品离子经过迁移区的时间减小，沿垂直电极板方向的位移减小，离子未碰撞到迁移区极板上的几率增加[14]，导致半峰宽增加，分辨率降低。因此，综合考虑灵敏度和仪器的分辨率，选择样品气流速0.1 L/min，载气流速为2.0 L/min作为样品的测试条件。

图1 顶空温度的影响Fig. 1 Effect of head-space temperature

2.2 不同霉变程度的烟草的FAIMS 谱图

依据优化后的实验条件，烟草均在正模式下有明显的特征信号出现。在不同的电场强度下进行补偿电压和离子电流值的连续扫描，得到不同的响应信号，烟草在正模式下有较为明显的特征峰，不同霉变程度的烟草全场扫描所得的典型谱图如图3所示。由于霉变程度不同，烟草所含有的特征物质的量不同，测试所得的离子电流值不同。霉变的程度决定了其在正模式下图谱的信号。三种不同霉变程度的烟草在电场强度为40%的信号对比图如图3(D)所示：霉变程度越重，特征峰离子电流值越低；霉变越轻，特征峰离子电流值越高。

图2 载气流速的影响Fig. 2 Effect of carrier-gas flow rate

图3 FAIMS烟草图谱Fig. 3 FAIMS spectrum of different mildew tobacco

2.2.1 TD-GC-MS烟草霉变标记物筛查验证测试

依据验证测试流程，从203种烟草样本中随机选择30种未霉变和30种霉变烟草，进行TD-GC-MS测试，对比FAIMS检测烟草所得特征峰信号，对烟草霉变特征标记物质筛查判定。根据测试结果，选择具有代表性的未霉变烟草和霉变烟草的色谱分析结果，如图4中A（不同霉变程度烟草总离子流图）和B（图A中测试时间4.5 min至6 min范围内信号放大图）所示：根据质谱分析得出烟草霉变的特征标记物为吡啶和1-戊醇，实验选择最终有响应信号的特征物质作为分析对象，传统霉变标记物对于FAIMS无明显响应(由于FAIMS的特殊离子交换反应机理，烟草自然挥发形成的吡啶和1-戊醇响应信号远远强于蘑菇醇，无法获得该物质的特征信号；麦角甾醇由于较高的熔沸点在室温下难形成样品气被检测到）。由于FAIMS检测所得样品信号强度与样品含量成正比，根据烟草测试响应信号对比分析得到：未霉变烟草中1-戊醇的相对含量较高，吡啶较低，当烟草霉变后，1-戊醇的相对含量降低，吡啶的含量增加，当烟草霉变较重时吡啶的相对含量最高。

2.2.2 烟草霉变FAIMS特征标记物验证

依据TD-GC-MS筛选出的特征标记物1-戊醇（A）和吡啶（B）与不同霉变程度烟草FAIMS特征物质的图谱进行验证比对。如图5与图6所示：在场强DF为40%下，1-戊醇（a）与未霉变烟草(b)的特征峰二维图的补偿电压值一致，吡啶(c)与霉变严重烟草(d)的特征峰的二维图的补偿电压值一致。烟草霉变特征物质的离子电流值变化趋势与FAIMS测试结果相符。

2.3 烟草霉变识别

结合FAIMS技术不同电电场强度度下物质的特征峰响应信号的差异，开发了识别不同物质的规则方法和识别软件。考虑本实验检测物质为烟草，不同霉变程度的烟草在正模式下的特征信号差异变化较为明显，本文选择正模式建立识别规则点，对烟草是否霉变进行判定。识别点包含补偿电压（CV）值、电场强度（DF）值和离子电流值（ICV）三个变量。若被测物质在识别区域内同时满足设定规则三个变量的要求，即在指定的CV值和DF值下，离子电流值符合设定的要求，判定标准即识别规则点为全黑即符合，给出定性判别结果。识别规则如表1所示。利用含三种变量的规则识别软件分别对203种烟草样本进行识别，其中正确判定为霉变严重的有36种，霉变轻的有24种，未霉变的有130种，识别结果依据烟草霉变行标测试进行对比验证，正确率达90%以上，误判率小于10%（依据测试烟草行标验证结果，对比制定烟草识别规则要求：10种未霉变烟草错判定为霉变轻烟草，3种霉变轻烟草错判定为霉变重烟草）。识别判定图示如图7所示：未霉变烟草(1)；霉变较轻烟草(2)；霉变严重烟草(3)。

图4 不同霉变程度烟草总离子流图Fig. 4 Total ion current chromatogram of different mildew degree of tobacco

图5 特征物质FAIMS谱图Fig. 5 FAIMS spectrum of characteristic substances

图6 特征物质样品信号与烟草特征信号对比Fig. 6 Characteristic signal comparison between samples and tobacco

表1 烟草霉变识别规则Tab. 1 Recognition rules of mildewy tobacco

2.4 烟草霉变识别特征参量差异性分析

霉变识别的重要特征参量离子电流值对于不同霉变程度的烟草其数值的分布范围不同。对比识别规则，从三种不同霉变状态烟草测试总数据中（每个烟草样品均重复测试6次作为有效数据计算）各选择100个进行对比分析，三种状态烟草的离子电流值波动变化范围如图8A（50%DF离子电流值变化）和图8B（40%DF离子电流值变化）所示：离子电流值不存在交叉，差异明显，数值变化均符合识别规则设定的限值要求。从上述有效数据中随机抽取未霉变，霉变较轻和霉变严重烟草数据样本各41个，根据t检验法，对不同霉变程度烟草的离子电流值的差异显著性水平进行分析，分别计算40%DF和50%DF下不同状态烟草两两对比的t值，计算结果如表2中所示。依据t检验法查表得出t0.05,80=1.990，可见t计算均大于t表，说明三种不同状态烟草的离子电流值存在显著性差异，可明显识别区分。

图7 烟草识别结果Fig. 7 Recognition results of different tobacco

图8 不同霉变程度的烟草特征离子电流值的分布Fig. 8 Distribution of ion current value

同时对相同状态烟草的离子电流值的差异水平分析得出：40%DF下计算所得t值分别为0.03（未霉变）、0.003（霉变轻）和0.98（霉变重），50%DF下计算所得t值分别为0.61（未霉变）、0.27（霉变轻）和0.31（霉变重），t计算均小于t表，说明同种状态烟草的离子电流值无显著性差异，测试结果和方法可用。

2.5 方法的重复性

选取1种烟草为例，严格控制操作条件，按照1.2的方法制得6份相同的烟草样品，在上述优化后的条件下进行检测，所得的正模式下3个峰的峰值（离子电流值）的相对标准偏差RSD≤5%，该方法的重复性良好。

3 结论

综上所述，采用顶空进样-芯片级FAIMS检测技术对203种烟草进行快速检测分析，利用烟草在正模式的特征峰的响应信号建立识别规则，以响应信号在特定CV值对应的离子电流值作为识别依据，使得霉变程度不一的烟草得到有效检测识别，识别正确率达到90%以上，不同霉变程度烟草测试所得特征峰离子电流值存在显著性差异，有利于烟草霉变正确识别。方法和数据的重复性较好。对于批量烟草霉变的快速识别还需进一步优化检测条件和识别软件规则，提高FAIMS对于烟草识别的能力。FAIMS技术可为今后烟草霉变快速检测和实时在线监控方法开发提供技术参考。

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Rapid identification of different tobacco mildew through microchip-based field asymmetric ion mobility spectrometry

ZHOU Yuanzhen1, ZHANG Qiang2, YANG Yitao1, LI Lingfeng3,4, WANG Xiaozhi4
1 Honghe Cigarette Factory, Hongyun Honghe Group, Mile 652399, Yunnan, China;2 Yunnan Reascend Tobacco Technology (Group) Co., Ltd, Kunming 650106, China;3 Suzhou Industiral Technology Research Institute, Zhejiang University, Suzhou 215000, Jiangsu, China;4 Department of Information Science & Electronic Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China

Microchip-based high-field asymmetric ion mobility spectrometry (FAIMS) technology was used for rapid identification of tobacco mildew. Sample gas was introduced by a dynamic headspace diffusion method. Using FAIMS technology, the sample was tested in positive and negative ion mode under atmospheric conditions with clean air (carrier gas: filtered by activated carbon and molecular sieve). To optimize detection conditions, carrier gas flow rate and sample flow rate were controlled at 2000mL/min and 100 mL/min, respectively. Headspace temperature was controlled at 25 ℃.Under optimal conditions, recognition rules of the degree of mildewy tobacco were established according to identification points. Identification points included three variables of the compensation voltage (CV), electric field (DF) strength and ionic current value (ICV).Characteristic substances of different mildewy tobacco were analyzed by TD-GC-MS. There was a significant difference among Ion current value of characteristic peaks for different mildewy tobacco. The recognition rate of this method was more than 90 percent with relative standard deviation(RSD) lower than 5%. Therefore, FAIMS detection technology has a great potential for application in rapid identification of tobacco mildew.

field asymmetric ion mobility spectrometry; tobacco mildew; identification

周沅桢，张强，羊一涛，等. 芯片级非对称场离子迁移谱技术快速识别不同霉变烟草[J]. 中国烟草学报，2016,22（6）

江苏省基础研究计划（自然科学基金）资助项目“基于MEMS工艺的新型离子源FAIMS技术的研究”（BK20130340）；浙江省博士后科研择优资助项目“基于MEMS工艺的新型离子源场强场非对称离子迁移谱的开发和理论研究”（BSH1302040）；中国博士后科学基金资助项目“基于碳纳米材料光电效应的新型离子源的研制”（2013M531448）

汪小知（1983—），副教授，博士研究生导师，主要从事微纳米器件、新型材料传感器的研究，Email：xw224@zju.edu.cn

2016-04-22

：ZHOU Yuanzhen, ZHANG Qiang, YANG Yitao, et al. Rapid identification of different tobacco mildew through microchip-based field asymmetric ion mobility spectrometry [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(6)