兰州地区难治性肺炎病毒病原检测及临床研究

张蓉芳 谢志萍 高寒春 刘东海 石永生 王永军 李桂荣 王卫凯 蒋成鹏 段招军

730050 兰州，甘肃省妇幼保健院(张蓉芳、刘东海、石永生、王永军、李桂荣、王卫凯、蒋成鹏)；100052 北京，中国疾病控制中心病毒病预防控制所(谢志萍、高寒春、段招军)



·论著·

兰州地区难治性肺炎病毒病原检测及临床研究

张蓉芳 谢志萍 高寒春 刘东海 石永生 王永军 李桂荣 王卫凯 蒋成鹏 段招军

730050 兰州，甘肃省妇幼保健院(张蓉芳、刘东海、石永生、王永军、李桂荣、王卫凯、蒋成鹏)；100052 北京，中国疾病控制中心病毒病预防控制所(谢志萍、高寒春、段招军)

目的 探讨兰州地区难治性肺炎患儿中病毒病原的感染状况及临床特点 方法 收集2013年1月至2013年12月甘肃省妇幼保健院难治性肺炎患儿肺泡灌洗液100例，应用PCR及RT-PCR方法检测9种常见呼吸道病毒：鼻病毒(HRV-A，B，C)，呼吸道合胞病毒(RSV)，偏肺病毒(hMPV)，流感病毒(IFVA，IFVB)，副流感病毒1-3(HPIV1-3)，冠状病毒(HCoV-HKU1、 HCoV-NL63)，肠道病毒(EV)及腺病毒(AdV)，博卡病毒(HBoV)。结果 53例标本病毒病原检测阳性，其中AdV阳性标本40例，检出率40%;其中AdV7型占大多数，共33例;其次为AdV2有6例，AdV1有1例;RSV 18例;检出率18%，IFVB5例，检出率5%;HRV4例，检出率4%;EV-68 1例;13例混合感染，混合感染率为24.53%(13/53)。腺病毒阳性和阴性患儿的临床特征比较显示：发热、呼吸衰竭、发绀和肺部实变4个临床表现在腺病毒阳性患儿中发生率高。结论 病毒在兰州地区难治性肺炎中占有很重要的地位，其中腺病毒、尤其是AdV7型为当地流行的最主要的病毒病原，在临床治疗中应给与高度关注。

Fundprograms:HealthCareIndustryProjectPlan(GSWST2012-12);NationalNaturalScienceFoundationofChina(81260001)

急性呼吸道感染(Acuterespiratorytractinfection，ARTI)是世界范围内威胁婴幼儿健康的主要疾病，其中难治性肺炎占有很大的比例，ARTI的病原学十分复杂，目前引起我国儿童急性呼吸道感染的病原体仍以病毒最为突出[1-3]，我们研究组前期工作证实兰州地区呼吸道感染患儿病毒感染率为73.92%[4]。

难治性肺炎是指病情严重或病程长、经抗感染药物积极治疗无改善、迁延不愈甚至恶化的一类肺炎，目前难治性肺炎是临床医生面临的一大难题。兰州地处西北经济欠发达地区，难治性肺炎病毒病原的资料很少，而新发呼吸道病毒，包括鼻病毒C群、偏肺病毒、博卡病毒在难治性肺炎患儿中的感染状况不清楚，了解难治性肺炎的病毒病原谱对临床治疗提供帮助。

本研究对2013年1月-2013年12月间甘肃省妇幼保健院收治的100例难治性肺炎患儿肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid)，采用PCR和RT-PCR的方法进行了病毒病原[RSV、IFV(A，B)、PIV1-3、HRV(A，B，C)、AdV、hMPV、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HBoV]的检测，对临床资料进行了回顾性分析，探讨病毒病原的分布及临床特点。

1.1 资料及方法

1.1 临床标本的收集 选择2013年1月- 2013年12月甘肃省妇幼保健院收治的难治性肺炎患儿100例，均符合实用儿科学第七版肺炎诊断标准，且病程3 周以上疗效不佳或病程在1 周以内，但X线胸片或胸部CT有明显实变或不张，经常规治疗1周症状、体征和胸部X线表现无明显改善的患儿，所有患儿血CRP<1mg/L，痰细菌培养阴性。于就诊当日采集患儿肺泡灌洗液，入一次性灭菌痰液收集器，采集过程征得家属同意。第1管送细菌培养，第2管送细胞学检查，第3管送-80 ℃冰箱保存，转运至中国疾病预防控制中心做进一步研究。

1.2 临床标本的处理 肺泡灌洗液标本室温化冻，高速漩涡振荡至成水样。在超净工作台内转至2mlEP管中。5000转离心5min，取上清液, 用于病毒RNA，DNA的提取，剩余的标本-80 ℃冰箱保存。

1.3 病毒RNA/DNA的提取 用QIAampviralDNAminikitandQIAampviralRNAminikit(Qiagen,Beijing,China)提取患儿肺泡灌洗液标本上清中的总RNA和DNA，操作按试剂盒说明书进行。用RNA为模板，应用随机引物(Invitrogen)进行逆转录合成cDNA，然后进行PCR的扩增，实验引物及反应条件参考[4,5]。

1.5 结果检测 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性产物送北京华大基因研究中心进行核苷酸序列测定。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0进行统计学分析，率或构成比的比较采用χ2检验和Fisher精确概率法，检验水准设为0.05。

2 结果

2.1 临床标本中一般资料 100例难治性肺炎患儿中：男性61例，女性39例，年龄2个月-13岁，其中2个月-1岁13例、1岁-3岁42例、3岁-7岁38例、7岁-13岁7 例，病程 8d-1年， 其中发热81例、咳嗽98例、喘息48例、紫绀21例、咯血2例、呼吸困难18例、肺部啰音89例、肺部实变体征11例、呼吸衰竭16例。肺部CT或X线胸片表现为渗出性病变 62例、实变11例、气肿2 例、肺不张4 例、胸腔积液2例。其中2例死亡病例。

2.2 病毒病原的检测 本组肺泡灌洗液病毒阳性标本共53例；阳性率为53%，其中AdV40例(AdV7型33例，AdV1型1例，AdV2型6例)，RSV18例，IFVB5例，HRV4例，EV68 1例;其中13例混合感染，AdV和RSV混合感染8例，IFVB和AdV，RSV混合感染为1例，AdV和HRV混合感染1例，IFVB和AdV3例，混合感染率为13%。

2.3 年龄分布特点 病原检出情况的年龄分布如表1所示。各年龄组间病原检出率均差异无统计学意义(χ2=3.37 P>0.05)。

2.4 腺病毒阳性阴性患儿的临床特征 在40例腺病毒阳性患儿中，男女性别比为2.7∶1，在47例病毒检测阴性患儿中性别比仅为1.2∶1，两者之间无统计学差异(χ2=3.13 P>0.05)。表2显示了腺病毒阳性和阴性患儿的临床特征。发热、呼吸衰竭、发绀和肺部实变四个临床表现在腺病毒阳性患儿中发生率较阴性患儿高。

表1 不同年龄病原检出情况

表2 腺病毒阳性和阴性患儿中临床特征分析

注：采用Fisher精确概率法

Note: Using Fisher’s exact test

本次检测1至4季度分别收集难治性肺炎患儿肺泡灌洗液标本28、20、18和34份。图1显示了不同季度腺病毒阳性检出率。各季度间腺病毒阳性检出率差异无统计学意义(χ2=0.20P>0.05)。

图1 不同季度腺病毒阳性检出率Fig.1 Quarterly distribution of AdVs infections

3 讨论

我们共检测了100例难治性肺炎肺泡灌洗液标本，其中病毒检出率为53%，和国外的报道一致，既往多认为导致难治性肺炎的病原体主要是细菌、真菌、结核等病原，对病毒在难治性肺炎中所起的作用，了解十分有限。国外已有较多报道证实病毒病原是难治性肺炎患儿主要病因：Akhtar等[6]采用PCR方法在需要机械通气的肺炎患儿的气管导管吸取物中检测腺病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、肠道病毒、RSV、IFV-A和IFV．B八种呼吸道病毒，其病毒总检出率为56%。Van de Pol等在入住PICU急性下呼吸道感染的患儿中采用病毒培养和直接免疫荧光方法病毒总检出率为48%，同时采用荧光定量PCR病毒检出率则高达96%[7]。

腺病毒的检出率为40%，40例腺病毒阳性标本中AdV 7型占33例，AdV 2型6例，AdV 1型1例，而在兰州地区普通呼吸道感染患儿中腺病毒的感染率为6.33%[8]，腺病毒在难治性肺炎中的感染率明显高于普通呼吸道感染。因为取材相对容易，国内外大多数对儿童呼吸道病原的研究采用的标本为鼻咽分泌物，而本研究对象为支气管肺泡灌洗液(BALF)，纤支镜下BAL直接取材于病变部位，对支气管肺泡灌洗液成分的分析，较痰培养更能客观地反映患儿下呼吸道病原的状况。

人类腺病毒属于双股DNA病毒，迄今已发现58种血清型，归为A-G 7个亚群，既往的研究显示：AdV7是儿童呼吸道感染的一个重要的病毒病原，往往导致严重的下呼吸道感染和高的死亡率，尤其是在小婴儿和免疫缺陷的患儿中。一项阿根廷的研究显示，呼吸道感染的死亡病例28.6%是由AdV7感染导致[10]，本组资料显示AdV7同样是兰州地区难治性肺炎的一个重要的病毒病原，在难治性肺炎中占有很高的感染比例(33%)，腺病毒阳性和阴性患儿的临床特征比较显示，发热、呼吸衰竭、发绀和肺部实变四个临床表现在腺病毒阳性患儿中发生率更高。AdV引起的呼吸道感染可以全年散发，流行或暴发流行，大多数的研究中，AdV呈地方性的全年散发，但是AdV引起的暴发流行在过去几十年常有报道[4,5,9],。本研究中，AdV呈全年散发，未观察到季节流行特点。新发病毒如HRV-C在本研究共检测出2例，EV68检测出1例，而偏肺病毒(Human Metapneumovirus, HMPV)，人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)，冠状病毒NL-63和HKU1(HCoV-NL63，HCoV-HKU1)在本次研究中未检测到。

本研究采用灵敏度和特异性均很高的PCR及RT-PCR，分析了难治性肺炎患儿数种常见和新发呼吸道病毒感染情况，本组数据证明病毒在难治性肺炎病原谱中占有很重要的地位，其中腺病毒的感染尤其重要。本研究对兰州地区难治性肺炎儿童中病毒感染状况、临床特点做初步的研究，为临床医生提供科学理论依据并指导临床的治疗，避免抗生素的滥用，并为疫苗的研制提供流行病学资料。

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Analysis of respiratory viruses detection and clinical feature analysis in children with refractory pneumonia in Lanzhou area

ZhangRongfang,XieZhiping,GaoHanchun,LiuDonghai,ShiYongsheng,WangYongjun,LiGuirong,WangWeikai,JiangChengpeng,DuanZhaojun

GansuProvincialMaternityandChildrenCareHospital,Lanzhou, 730050,China(ZhangRF,ShiYS,WangYJ,LiuDH,LiGR,WangWK,JiangCP);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China.(XieZP,GaoHC,DuanZJ)

s:ZhangRongfang,Email:lazyrfang@126.com;DuanZhaojun,zhaojund@126.com

ObjectiveThestudywastoinvestigationthecontributionof9respiratoryvirusesandclinicalfeaturesofrefractorypneumoniainchildreninLanzhouarea.MethodsIntotal, 100bronchoalveolarlavagefluidwerecollectedfromchildrenyoungerthan14yearswithrefractorypneumoniabetweenJanuary2013andDecember2013.Thepolymerasechainreaction(PCR)wasusedtoscreenhumanrespiratorysyncytialvirus(HRSV),humanmetapneumovirus(HMPV),influenzavirusesAandB(IFVA,IFVB),parainfluenzavirustypes1to3 (PIV1-3),humanrhinoviruses(HRVs),andhumancoronaviruses(HCoV-NL63andHKU1),enterovirus(EV)usingastandardreverse-transcriptionPCRtechnique,adenovirus(AdVs)andhumanBocavirus(Bcov)usingtraditionalPCRmethods.AllPCR-positiveproductsweresequenced.ResultsViralagentswereidentifiedin53% (53/100)ofspecimens,includingAdVin40%(40/100),followedbyRSVin18%(18/100),IFVBin5% (5/100),HRVin4%(4 /100),EV-68wasfoundinonecase.AmongAdVpositivecases,AdV7 (33/40)wasdetectedmostfrequently,followedbyAdV2in15% (6/40),AdV1in2.5%(1/40),Thecoinfectionrateofpositivesamplewas24.53%(13/53).ConclusionsVirusesplayanimportantroleinrefractorypneumoniainchildreninLanzhouarea.AdVisanimportantviralagentinchildrenwithrefractorypneumoniainLanzhouCity,especiallyAdV7.Thefrequencyoffever,respiratoryfailure,cyanosis,andpulmonaryconsolidationweresignificantbetweenAdVpositivesampleandnegativesample.

Refractorypneumonia;PCR;Viralpathogens;Children

张蓉芳，Email:lazyrfang@126.com；段招军，Email：zhaojund@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.012

难治性肺炎;PCR; 病毒病原; 儿童

甘肃省卫生行业项目计划(GSWST2012-12);国家自然科学基金(81260001)

2016-01-16)